与年龄相关的脑中中脑星形胶质细胞源性神经营养因子表达的变化及其对神经行为功能的影响

《Mechanisms of Ageing and Development》：Age-related alterations in the expression of mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor in the brain and their impact on neurobehavioral functions

脑内MANF表达随年龄增长显著下降，各脑区如皮层、小脑等均出现表达减少，且雌性较雄性下降更明显。通过构建小脑Purkinje细胞特异性MANF缺失模型，发现雄性小鼠社交行为增强，雌性社交退缩，两性别均出现空间学习记忆减退，提示MANF衰减与性别相关神经行为改变及脑老化相关。

　　

作者：Di Hu | Wen Wen | Hui Li | Zuohui Zhang | Hong Lin | Jia Luo

美国爱荷华大学卡弗医学院病理学系，爱荷华州爱荷华城，邮编52242

摘要

中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子（MANF）是一种位于内质网（ER）中的神经营养蛋白，在维持内质网稳态中起着关键作用。内质网是蛋白质合成、折叠、降解和分泌（蛋白质稳态）的核心，在神经退行性疾病（NDDs）中会受到显著压力，这会激活未折叠蛋白反应（UPR）。衰老是NDDs的主要风险因素，与内质网功能受损有关。研究表明，MANF在多种NDDs的实验模型中具有保护作用。我们假设大脑中MANF的表达会随年龄增长而下降，从而可能增加患NDDs的风险。我们测量了1个月、4个月、11个月和22个月大的雄性和雌性小鼠大脑和血浆中的MANF水平，发现MANF水平呈逐渐下降趋势，22个月大的小鼠中MANF水平最低。在包括大脑皮层、嗅球、丘脑、下丘脑、海马体和小脑在内的多个脑区，老年小鼠的MANF表达均降低。老年小鼠的MANF水平存在性别差异。衰老还改变了UPR及相关蛋白的表达。通过使用小脑浦肯野细胞（PC）特异性的MANF缺陷小鼠，我们发现MANF缺乏会损害雌性小鼠的运动协调能力，但不会影响雄性小鼠；同时，MANF缺乏会削弱雄性和雌性小鼠的空间学习和记忆能力。总体而言，大脑中的MANF表达随年龄增长而下降，MANF缺乏对神经行为的影响具有性别特异性。

引言

内质网（ER）是一种重要的细胞内器官，参与蛋白质折叠和加工、膜生物合成、钙的储存和释放，并作为分泌途径的入口。由于这些多样的功能，内质网是蛋白质质量和细胞稳态（蛋白质稳态）的关键调节器。蛋白质稳态受到营养缺乏、钙或氧化还原水平失衡等因素的影响，可能导致错误折叠蛋白质的积累，从而引发内质网应激。内质网应激会激活未折叠蛋白反应（UPR），这是一种适应性机制，旨在恢复蛋白质稳态或在损伤无法修复时启动细胞凋亡（Meiseles等人，2025年）。与衰老相关的神经退行性疾病的显著诱因是蛋白质稳态的丧失和线粒体功能障碍（Wodrich等人，2022年）。新的证据表明，内质网应激和UPR与阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等与年龄相关的神经退行性疾病的发病机制有关（Wodrich等人，2022年；Singh等人，2024年）。 中脑星形胶质细胞来源的神经营养因子（MANF），也称为早期肿瘤中精氨酸富集的突变蛋白（ARMET），是一种20 kDa的分泌蛋白，属于一个进化上保守的神经营养因子家族（Danilova等人，2019年）。最初被确定为多巴胺神经元的营养因子，MANF在发育中和成年中枢神经系统（CNS）中广泛表达，并在内质网应激时上调。大脑中的MANF缺乏可能激活UPR通路（Pakarinen等人，2020年），并在病理条件下维持蛋白质稳态（Wen等人，2022年；Pakarinen和Lindholm，2023年）。此外，MANF还调节神经发育过程，包括神经发生、神经元存活、分化和轴突生长（Wang等人，2022年；Wen等人，2020年；Tseng等人，2017年）。它在多种神经病理学条件下具有神经保护作用，通过减轻内质网应激来减少帕金森病、缺血、脊髓小脑性共济失调和视网膜损伤等模型的神经退行性变化（Petrova等人，2003年；Lindholm等人，2008年；Airavaara等人，2009年；Voutilainen等人，2009年；Yu等人，2010年；Zhang等人，2023年）。我们之前的研究表明，大脑中的MANF表达受发育调控，暗示其参与神经发育（Wang等人，2014年）。由于MANF参与蛋白质稳态的调节，它也可能在大脑衰老过程中发挥作用。 先前的研究报道了小鼠皮肤、白色脂肪组织、肝脏和骨骼肌等外周组织中MANF表达随年龄增长的下降（Sousa等人，2023年；Sousa-Victor等人，2019年）。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中也观察到了类似的年龄依赖性MANF下降（Richman等人，2018年；Taylor等人，2024年）。由于MANF与NDDs的易感性有关，我们试图确定不同哺乳动物脑区中MANF表达是否随年龄下降。我们测量了1个月、4个月、11个月和22个月大的雄性和雌性小鼠大脑和血浆中的MANF水平，发现这两个部位的水平均呈逐渐下降趋势，22个月大的动物中MANF水平最低。区域特异性分析显示，老年小鼠的多个脑区（包括大脑皮层、嗅球、丘脑、下丘脑、海马体和小脑）的MANF表达显著降低。值得注意的是，血浆和小脑中的MANF表达存在性别差异，老年雌性小鼠的MANF水平明显低于同龄雄性小鼠。由于其他因素也可能导致与年龄相关的NDDs，我们还研究了UPR、MANF相互作用蛋白、细胞凋亡和神经炎症的年龄相关变化。为了模拟大脑中与年龄相关的MANF缺乏，我们生成了一种浦肯野细胞（PC）特异性的MANF敲除（KO）小鼠品系。PC中MANF的缺失导致雌性小鼠的运动协调能力下降，而雄性小鼠未受影响；MANF缺乏还削弱了雄性和雌性小鼠的空间学习和记忆能力。雄性MANF缺乏小鼠表现出更高的社交性，而雌性小鼠则表现出社交退缩。综上所述，大脑中的MANF表达随年龄增长而下降，MANF缺乏对神经行为的影响具有性别特异性。

试剂

试剂

氯胺酮/赛拉嗪（Ketamine/xylazine）购自Butler Schein Animal Health（俄亥俄州都柏林）。Fast Tissue/Tail PCR基因分型试剂盒（G1001）购自EZ BioResearch（密苏里州圣路易斯）。DC蛋白测定试剂盒II（5000112）购自Bio-Rad（加利福尼亚州赫拉克勒斯）。ECL Prime Western Blotting检测试剂（45?002?401）购自GE Healthcare Life Sciences（新泽西州皮斯卡特维）。抗ARMET/ARP（MANF）（ab67271）、抗ATF6（ab203119）、抗磷酸化IRE1α（ab48187）、抗切割的caspase-12（ab62463）等试剂均购自相关供应商。

大脑和血浆中MANF表达的年龄和性别相关变化

我们首先使用免疫印迹（IB）分析检测了1个月、4个月、11个月和22个月大的小鼠大脑皮层和小脑中的MANF蛋白表达水平。虽然1个月时雄性大脑皮层中的MANF表达最高，但这种表达随年龄增长逐渐下降，到22个月时降至显著低水平（图1A和B）。1个月时雌性大脑皮层中的MANF水平也显著高于4个月、11个月和22个月时（图1C和D）。

讨论

本研究表明，大脑和血浆中的MANF水平随年龄增长而逐渐下降，22个月大的小鼠中MANF水平最低。这种MANF表达的下降在多个脑区（包括大脑皮层、嗅球、丘脑、下丘脑、海马体和小脑）均明显存在。值得注意的是，老年雌性小鼠的MANF水平普遍低于同龄雄性小鼠。衰老还影响了某些UPR相关蛋白的表达。

作者贡献声明

Hong Lin：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、项目管理、数据管理。 Zuohui Zhang：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究。 Jia Luo：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、数据可视化、实验监督、项目管理、资金申请、概念构思。 Di Hu：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、数据管理。

伦理批准

所有实验动物程序均获得了爱荷华大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准号#0032295），并按照美国国立卫生研究院（NIH）制定的实验室动物护理和使用规定进行。

资助

本工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助（项目编号：AA017226和AA015407）。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。