羟基化树状大分子纳米凝胶可同时输送药物和细胞因子，用于胶质瘤的化学免疫治疗

《Materials Today Bio》：Hydroxylated dendrimer nanogels co-deliver drugs and cytokines for chemoimmunotherapy of glioma

双pH/ROS响应性树状聚合物纳米凝胶平台通过增强渗透保留效应和pH/ROS双响应释放机制实现血脑屏障穿透，协同化疗药物TPZ与免疫调节因子IFN-γ治疗胶质瘤。

　　
胶质瘤作为中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，其治疗面临多重挑战。传统化疗药物因血脑屏障（BBB）的限制难以精准递送至肿瘤部位，而肿瘤微环境（TME）的免疫抑制特性进一步削弱了免疫疗法的效率。近年来，纳米递送系统因其独特的物理化学性质成为突破BBB屏障和优化TME免疫微环境的关键载体。本研究团队创新性地开发了基于第三代聚酰胺胺（G3 PAMAM）树状大分子的双响应纳米凝胶（DNGs）平台，通过pH和活性氧（ROS）双重响应机制，实现化疗药物和免疫细胞因子的协同递送，为胶质瘤治疗提供了新思路。

### 一、研究背景与科学问题
胶质瘤的高复发率与以下因素密切相关：首先，肿瘤细胞通过形成致密血管网络和星形胶质细胞包裹，导致传统手术难以彻底清除病灶；其次，BBB作为血脑屏障的核心结构，通过紧密连接的内皮细胞和基底膜，阻断了98%以上的小分子药物及99.9%的蛋白质类生物制剂的直接渗透。这直接导致了两类治疗手段的局限性——化疗药物因渗透不足难以达到有效浓度，而免疫细胞因子（如IFN-γ）因半衰期短和易被免疫系统清除而疗效受限。

现有纳米递送系统多依赖复杂的表面修饰或细胞膜包被技术，不仅成本高昂，还面临批次稳定性差的问题。例如，基于脂质体的系统需要精确控制脂质比例，而聚合物纳米凝胶的制备常涉及多步偶联反应。因此，开发一种兼具高效BBB穿透能力、精准药物释放机制和免疫微环境调控功能的简单纳米平台，成为当前研究的热点。

### 二、材料设计与合成策略
研究团队选择G3 PAMAM作为核心材料，其优势在于：① 生成量可控（G3级数适中，易于合成）；② 表面羟基丰富（每分子含5.9个伯醇基团），为后续交联反应提供位点；③ 免疫原性低，符合生物相容性要求。具体合成路线包括三步关键步骤：
1. **PBA修饰**：通过溴化苯基硼酸（Br-PBA）与G3 PAMAM的氨基反应，引入可交联的硼酸酯基团，同时保留表面羟基的活性位点。
2. **羟基化修饰**：利用甘油醇（glycidol）的环氧基团与PBA修饰后的树状大分子羟基进行开环反应，形成稳定的羟基化结构，这一步骤使材料具备双重响应特性（pH和ROS敏感）。
3. **交联形成纳米凝胶**：采用逆微乳法将PBA修饰的树状大分子与含PBA端基的聚乙二醇（PBA-PEG-PBA）交联，形成三维网络结构的纳米凝胶（DNGs）。此方法的关键在于通过微乳液中的乳滴聚合实现均匀的纳米结构，同时避免传统有机溶剂的毒性残留。

### 三、功能特性与作用机制
#### （一）靶向递送系统构建
通过逆微乳法合成的DNGs具有显著的结构优势：其表面羟基密度高（每纳米颗粒含20-30个羟基），在酸性肿瘤微环境（pH 6.5）中可质子化形成带电表面，增强与血管内皮细胞的选择性结合；同时，纳米颗粒的尺寸（72.5 nm）和Zeta电位（19 mV）优化了其血液循环稳定性与跨膜运输效率。负载机制上，化疗药物TPZ通过物理包埋策略负载于纳米凝胶内部，而免疫调节因子IFN-γ则通过静电相互作用和离子π键与表面PBA基团结合，形成稳定的复合物。

#### （二）双重响应释放机制
DNGs-TPZ/IFN-γ的释放动力学与肿瘤微环境特征高度匹配：
1. **pH响应**：在肿瘤组织pH 6.5的酸性环境中，纳米颗粒表面质子化导致静电排斥作用减弱，TPZ从纳米载体中释放。研究表明，在pH 6.5联合10 mM H2O2条件下，48小时内TPZ释放量达46.3%，显著高于中性环境。
2. **ROS响应**：活性氧水平在肿瘤中心可达生理值的10倍以上。纳米颗粒中的PBA基团在氧化应激条件下发生断键，释放IFN-γ。实验显示，当ROS浓度超过临界阈值时，IFN-γ的释放效率提升3倍以上。

#### （三）协同治疗效应
1. **化疗效应增强**：释放的TPZ在缺氧环境下转化为高活性自由基，DNA断裂速率较富氧环境提高5倍。纳米载体通过EPR效应富集于肿瘤组织（肿瘤/正常组织药物浓度比达8:1），显著提升化疗效率。
2. **免疫激活机制**：
- **巨噬细胞极化**：IFN-γ诱导RAW264.7巨噬细胞向M1型转化，CD86阳性率提升至16.37%，同时抑制CD206（M2型标志物）表达。
- **树突状细胞成熟**：通过上调CD80和CD86分子表达，促进DCs成熟，形成有效抗原呈递网络。
- **T细胞激活与调节**：CD4+和CD8+ T细胞浸润量增加，而抑制性Treg细胞比例下降，形成免疫记忆效应。

### 四、体外评价体系
#### （一）细胞毒性实验
采用CCK-8法评估对胶质瘤细胞系（C6）的毒性：在100 μg/mL浓度下，DNGs自身对C6细胞存活率影响小于5%。当与TPZ联用时，48小时抑制率达78.2%（p<0.001），较游离TPZ提升2.3倍。联合IFN-γ后，细胞凋亡率（流式细胞术检测）达11.65%，显著高于单一治疗组的4.8%。

#### （二）BBB穿透能力验证
建立体外BBB模型（bEnd.3细胞单层），结果显示：
- DNG-TPZ/BSA-Cy5.5的跨膜效率达25.5%，较游离BSA提高81.25%
- 透过的纳米颗粒在bEnd.3细胞内经4小时后完成胞吞，12小时后开始从溶酶体逃逸
- 透膜纳米颗粒在脑 parenchyma中的滞留时间达6-8小时，满足药物动力学需求

### 五、体内实验与临床转化潜力
#### （一）动物模型构建
采用原位接种建立C6胶质瘤小鼠模型，通过MRI动态监测显示：
- DNG-TPZ/IFN-γ组肿瘤体积抑制率达92.7%（p<0.001）
- 生存期延长至20天（80%存活率），较单独化疗组提升4倍
- 血清IL-6和TNF-α水平在治疗第11天分别达28.5 pg/mL和42.3 pg/mL，较对照组提高3-5倍

#### （二）组织病理学分析
H&E染色显示，DNG-TPZ/IFN-γ组肿瘤细胞核密度降低至8.39%，Ki67阳性率仅剩5.2%，而对照组仍维持30%以上的增殖活性。TUNEL染色证实该组细胞凋亡率高达11.65%，显著高于其他组别（p<0.001）。

#### （三）免疫微环境重塑
脾脏流式分析显示：
- CD4+ T细胞比例达16.3%（p<0.01）
- CD8+ T细胞比例达52.3%（p<0.01）
- Treg细胞比例降至7.2%（正常水平15-20%）

脑组织免疫荧光染色进一步证实，CD4+/CD8+ T细胞在肿瘤实质中的密度较其他组别提升2.8倍，同时CD206+巨噬细胞减少57.3%。

### 六、技术优势与临床应用前景
#### （一）创新性技术突破
1. **制备工艺简化**：采用逆微乳法实现一步法交联，较传统多步偶联工艺节省70%的合成时间。
2. **双响应协同释放**：pH和ROS双重触发机制使药物释放精准匹配肿瘤微环境特征，减少脱靶效应。
3. **免疫调控网络优化**：通过IFN-γ的时空缓释，构建"化疗破冰-免疫激活"的协同效应。

#### （二）临床转化优势
1. **生物安全性**：Hemolysis实验显示红细胞破裂率<5%，ALT/AST等肝肾功能指标均处于正常范围。
2. **规模化生产可行性**：逆微乳法使用工业级 Span 80/Tween 80，成本降低60%。
3. **多功能集成**：可扩展搭载其他免疫检查点抑制剂（如PD-1抗体）或光热转换剂，适应多种肿瘤类型。

### 七、未来研究方向
1. **递送系统优化**：探索表面修饰策略（如荧光素修饰）实现治疗过程可视化
2. **联合疗法探索**：测试与CAR-T细胞疗法、外泌体疗法的协同效应
3. **生物标志物发现**：通过单细胞测序解析TME中免疫细胞亚群动态变化

本研究成功构建了首个双响应纳米平台，其通过物理化学特性与治疗逻辑的完美统一，实现了从BBB穿透到免疫微环境调控的全程治疗闭环。这种"智能载体+精准药物+免疫激活"的三位一体策略，为克服胶质瘤治疗瓶颈提供了重要技术范式。后续研究可重点关注纳米颗粒在免疫检查点处的分布特性，以及如何维持长期免疫记忆效应，这将为胶质瘤的根治性治疗提供理论支撑。