水凝胶包裹的Calendula officinalis L.细胞外囊泡——通过巨噬细胞重编程促进骨折愈合的新方法

《Materials Today Bio》：Hydrogel-Wrapped Calendula officinalis L. extracellular vesicles - A novel approach to enhance fracture healing by Macrophage reprogramming

本研究通过单细胞RNA测序揭示骨折愈合中M1巨噬细胞极化的分子机制，并鉴定MMP12为关键靶点。通过构建磷脂酰丝氨酸修饰的金盏花外泌体响应性水凝胶，有效调控巨噬细胞极化并促进骨再生，为骨折修复提供了新策略。

　　
该研究聚焦于骨折愈合过程中巨噬细胞极化调控机制的探索，并开发了一种新型生物材料——响应性水凝胶负载植物外泌体（COEVs）以促进骨再生。研究结合单细胞测序、网络药理学及生物材料工程学，揭示了M1型巨噬细胞在骨折延迟愈合中的核心作用，并通过设计靶向递送系统实现了治疗效果的提升。

**骨折愈合中的炎症调控机制**
研究发现，骨折部位的炎症微环境显著影响巨噬细胞极化状态。单细胞RNA测序显示，非union骨折组中M1型巨噬细胞比例显著升高，其特征基因如MMP12、TNF-α等表达量增加，而M2型巨噬细胞相关基因（Arg-1、IL-10）则下调。通过细胞互作网络分析发现，非union骨折中M1巨噬细胞与成骨细胞存在高频次交互，这种异常的免疫-骨代谢对话可能阻碍骨修复进程。炎症通路如NF-κB和IL-17信号通路在非union组中被显著激活，提示M1极化是炎症持续状态的重要标志。

**植物外泌体的靶向调控策略**
研究选取菊科植物金盏花（Calendula officinalis）来源的外泌体（COEVs）作为治疗载体。通过网络药理学分析，发现COEVs中三萜类化合物（占比16.6%）与炎症相关基因（如MMP12）存在潜在调控关系。进一步实验证实，MMP12是COEVs调节巨噬细胞极化的关键靶点。当COEVs被磷脂酰丝氨酸（PS）修饰后，其巨噬细胞靶向效率提升3倍以上，且通过ROS响应性释放机制实现了精准递送——在骨折高炎症环境（ROS水平升高）中触发外泌体释放，而正常组织则保持稳定。

**响应性水凝胶的工程创新**
团队开发了一种基于硼酸酯动态键的水凝胶（Gel-BA/KGM），其特性包括：
1. **力学性能**：储能模量（G′）达500 kPa，可承受240%应变而不破裂，适用于骨骼植入环境。
2. **靶向递送系统**：通过PS修饰实现外泌体对M1巨噬细胞的特异性识别，结合ROS响应性降解机制，使外泌体在炎症区域（pH 5.0-7.0，ROS浓度>0.5 mM）实现72小时内100%释放。
3. **生物相容性**：经过血液相容性测试（红细胞溶血率<5%），并在肾、肝等器官无毒性表现，支持长期体内应用。

**治疗效应验证**
体外实验表明，负载COEVs的水凝胶可使M1→M2极化转换效率提升58%，伴随iNOS（M1标志物）表达量下降至对照组的10%，而Arg-1（M2标志物）表达量上升3倍。共培养实验显示，这种极化转变促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）成骨分化，ALP活性提高34%，钙结节沉积量增加2.1倍。
体内实验中，接受水凝胶治疗的鼠类模型8周后骨再生体积（BV/TV）达12.66%，显著高于对照组（4.27%）。Micro-CT三维重建显示，治疗区域骨密度（BMD）提升44%，骨小梁厚度（Tb.Th）增加126%，且新生骨呈现典型板层状结构，证明水凝胶有效诱导了M2型巨噬细胞介导的骨重建微环境。

**技术突破与临床转化潜力**
1. **多组学整合分析**：通过scRNA-seq结合代谢组学（检测到284种脂质分子），首次绘制了骨折部位巨噬细胞极化与外泌体成分的调控图谱。
2. **动态释放系统**：水凝胶在pH 5.0或H?O?刺激下48小时内完全降解，同时实现外泌体释放效率>95%。
3. **成本效益优势**：金盏花作为常见药用植物，提取成本仅为动物源性外泌体的1/5，且避免了动物源性成分的免疫原性问题。

**现存挑战与未来方向**
研究指出当前技术面临三大瓶颈：
1. **批次稳定性**：植物外泌体因来源差异可能导致治疗效果波动，需建立标准化制备流程。
2. **长期安全性**：虽8周实验未发现器官毒性，但需验证6个月以上的慢性炎症抑制效果。
3. **免疫原性调控**：PS修饰虽提升靶向性，但可能引发巨噬细胞吞噬泡应激，需进一步优化表面修饰。

未来研究建议：
- 开发金盏花规模化培养及外泌体标准化制备技术
- 探索联合生长因子（如BMP-2）的协同效应
- 建立动物模型与临床转化的桥梁实验（如猪骨缺损模型）
- 推动多中心临床试验验证疗效和安全性

该研究为生物材料与再生医学的交叉创新提供了范例，其核心价值在于建立了"炎症微环境-巨噬细胞极化-骨代谢调控"的完整干预链条。通过将基础研究（如单细胞测序揭示的MMP12调控网络）与工程技术（动态响应性水凝胶）相结合，成功将植物次生代谢产物转化为可临床应用的再生医学解决方案。这一技术路线可拓展至其他慢性炎症相关疾病（如糖尿病足、关节炎）的治疗开发。