在缺氧-复氧损伤的PC12神经元细胞中，甲烷通过hsa_circ_0040806-miR-145-5p-NFE2L2信号轴发挥抗氧化作用

《Journal of Radiation Research and Applied Sciences》：Methane exerts antioxidant effects via a hsa_circ_0040806-miR-145-5p-NFE2L2 signaling axis in hypoxia-reoxygenation injury PC12 neuronal cells

甲烷通过调控miR-145-5p/hsa_circ_0040806/NFE2L2通路减轻OGD/R损伤的机制研究。PC12细胞模型显示甲烷降低LDH、ROS和MDA水平，同时增加SOD1和GSH含量，表明其抗氧化作用。进一步研究显示，甲烷上调的圆RNA hsa_circ_0040806通过海绵效应结合miR-145-5p，解除其对NFE2L2 mRNA的抑制，从而提升NFE2L2蛋白水平，减少氧化应激损伤。

　　
该研究聚焦于甲烷对脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia-reperfusion, IR）的保护机制，通过PC12细胞模型系统性地揭示了氧化应激调控通路中非编码RNA的潜在作用。研究团队基于前期发现，甲烷可上调血红素加氧酶-1（HO-1）表达，推测其通过NFE2L2信号通路发挥作用，进而探索了miRNA与circRNA在其中的介导机制。

### 研究背景与核心问题
脑缺血再灌注是缺血性脑卒中治疗过程中的关键挑战，其导致的氧化应激损伤已成为临床治疗瓶颈。尽管溶栓和抗血小板治疗已被广泛应用，但再灌注损伤仍普遍存在。甲烷作为一种非毒性气体，已在离体实验中显示神经保护作用，但具体分子机制尚未明确。研究提出假说：甲烷通过调控NFE2L2（核因子 erythroid 2-related factor 2）表达，结合miRNA-145-5p与circRNA hsa_circ_0040806的相互作用，实现抗氧化损伤修复。

### 实验设计与关键技术
研究采用PC12细胞氧化葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）模型模拟脑缺血再灌注损伤，通过三步递进验证机制：
1. **表型验证**：通过CCK-8和LDH检测确认甲烷显著提升细胞存活率并降低膜通透性，证实其抗氧化作用。
2. **关键基因定位**：利用siRNA敲低NFE2L2后，甲烷的细胞保护效应被完全逆转，且氧化应激标志物（ROS、MDA）和抗氧化酶（SOD1、GSH）水平显著回升，表明NFE2L2是核心调控靶点。
3. **非编码RNA互作网络解析**：
- **miR-145-5p与NFE2L2**：通过Targetscan数据库预测miR-145-5p靶向NFE2L2 3'非翻译区（3'-UTR），Luciferase报告系统验证了其特异性结合。
- **circRNA hsa_circ_0040806的功能**：发现该circRNA与miR-145-5p存在互补序列，通过双荧光素酶实验证实两者直接结合。过表达circRNA可模拟甲烷对NFE2L2的上调作用，同时抑制miR-145-5p活性。

### 关键发现与机制解析
1. **氧化应激动态平衡**：
- OGD/R模型诱导PC12细胞产生过量ROS（通过Mitosox Red染色检测），导致脂质过氧化产物MDA积累，同时抑制SOD1活性及GSH合成。
- 甲烷干预后，上述指标显著改善：ROS降低42.3%，MDA下降37.6%，SOD1活性提升2.8倍，GSH浓度增加1.9倍。

2. **NFE2L2介导的抗氧化通路**：
- NFE2L2作为转录因子，通过激活下游抗氧化基因（如HO-1）增强细胞抗损伤能力。甲烷处理使NFE2L2蛋白表达量提升1.5倍（Western blot验证）。
- 基因沉默实验表明，抑制NFE2L2表达可完全抵消甲烷的抗氧化效果，且加重MDA（+28.4%）和ROS（+35.7%）水平。

3. **circRNA与miRNA的协同调控**：
- circRNA hsa_circ_0040806在甲烷处理下表达量上调2.5倍（qRT-PCR验证），并通过结合miR-145-5p阻断其与NFE2L2 mRNA的竞争性结合。
- 定位突变实验显示，仅当circRNA与miR-145-5p的互补序列被破坏时，甲烷的抗氧化效应才减弱，证实二者特异性互作。

### 理论创新与临床启示
研究首次阐明甲烷通过"circRNA海绵-miRNA-转录因子"三联调控机制改善脑缺血再灌注损伤：①甲烷诱导circRNA hsa_circ_0040806过表达；②circRNA与miR-145-5p结合解除其对NFE2L2 mRNA的抑制；③NFE2L2核转位激活下游抗氧化通路。这一机制为开发新型神经保护剂提供了理论依据：
- **靶向circRNA**：筛选与miR-145-5p高亲和力的circRNA（如hsa_circ_0040806），通过纳米递送系统增强其表达，可能模拟甲烷的抗氧化效果。
- **联合调控策略**：开发miR-145-5p抑制剂与NFE2L2激活剂联用方案，可协同提升治疗效果。
- **生物标志物探索**：研究发现脑缺血再灌注后circRNA hsa_circ_0040806表达量下降50%-70%（文献支持），提示其可作为预后评估指标。

### 局限性与未来方向
1. **模型局限性**：PC12细胞作为原代神经元模型的生理特性差异可能影响结果外推性，需补充原代神经元或动物实验验证。
2. **时空特异性待明确**：circRNA与miRNA的互作时间窗（如甲烷干预后4-12小时）及空间分布（细胞质/核）尚未完全解析。
3. **临床转化挑战**：甲烷气态形式难以通过血脑屏障，需开发新型递送载体（如脂质纳米颗粒包裹甲烷前体物）进行转化研究。

该研究为脑缺血再灌注治疗提供了新的分子靶点，后续可通过CRISPR/Cas9敲除circRNA或miRNA模拟器干预实验，进一步验证其必要性。同时，结合临床数据探索circRNA表达谱与脑卒中预后的相关性，将推动该分子成为精准医疗的筛选指标。