在器官芯片双腔平台上对血管化骨软骨组织进行模块化拆解与重组

本研究开发了一种双室组织芯片平台，通过模块化构建分别模拟软骨和血管化骨组织，并动态观察IL-1β对软骨-骨界面屏障的影响。结果显示，正常状态下软骨层能有效抑制血管和基质细胞迁移，而IL-1β处理导致界面屏障破坏，血管和基质细胞侵入软骨层，成功模拟骨关节炎病理过程，为机制研究和药物筛选提供新工具。

　　
该研究针对骨关节炎（OA）的病理机制及治疗挑战，提出了一种创新的“模块化”器官芯片平台，用于系统性研究骨-软骨界面多细胞互作。该平台通过分步构建和精确控制细胞微环境，揭示了OA早期血管化入侵的关键机制，为再生医学和药物开发提供了新工具。

### 一、研究背景与科学问题
骨关节炎作为全球最常见的关节退行性疾病，其病理机制涉及软骨细胞、骨前体细胞及血管系统的异常互作。现有研究多聚焦单一组织（如软骨或骨），但OA本质上是多组织协同失调的结果。关键科学问题包括：
1. 如何在体外精准模拟骨-软骨界面的动态互作？
2. 软骨屏障对血管迁移的调控机制是什么？
3. 是否存在可干预的分子信号通路改变疾病进程？

传统模型存在三大缺陷：①组织厚度超过细胞尺度（10^3 μm vs 10^4 nm），②无法动态观察界面互作，③细胞来源单一导致功能异质性。本研究通过微流控技术构建了具有光学透明通道的双腔室芯片，实现了对骨-软骨界面细胞互作的实时可视化观测。

### 二、方法创新与系统构建
#### 1. 平台架构设计
采用模块化设计理念，将传统多层PDMS结构简化为单层双腔室系统（图2）。核心创新包括：
- **仿生支柱结构**：50 μm宽六边形支柱阵列（间距50 μm）既防止介质泄漏，又形成约2 mm2的界面接触区（相当于真实关节界面面积）
- **动态微环境模拟**：通过更换培养液（CHM/OCM）和施加炎症因子（IL-1β），可分别调控软骨形成（CHM含TGF-β3）、骨矿化（OCM含β-Gly）和炎症状态
- **标准化培养流程**：单次注射即可完成细胞接种，培养周期统一为14天（软骨）和7天（血管化）

#### 2. 细胞来源与功能验证
- **软骨细胞**：采用原代健康膝关节软骨细胞（hACs），通过GFP标记实现追踪，其分化特性经RT-qPCR验证（COL2A1/OCN比值稳定在1:4.3）
- **骨前体细胞**：选用骨髓间充质干细胞（bmMSCs），通过mCherry标记和β-Gly诱导形成BSP2+、OCN+的骨样组织
- **内皮细胞**：采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs），通过3:2比例优化形成管腔直径40-60 μm的类血管结构（图4b）

#### 3. 多维度评估体系
- **分子层面**：qPCR检测12个关键基因（如IHH、BSP2），发现OCM条件下bmMSCs的ALP表达量较CHM提高2.8倍
- **组织结构**：通过DAPI-HA双染色观察矿化梯度，发现靠近软骨侧的bmMSCs仍保留20%的COL2A1表达
- **动态监测**：采用共聚焦显微成像（分辨率1 μm），每48小时采集图像，捕捉血管迁移的时序变化（图5e）

### 三、关键发现与机制解析
#### 1. 界面屏障的动态特性
- **健康状态**：软骨层（hACs）通过分泌TGF-β和FGF-2形成化学屏障，使HUVECs迁移率低于5%（图5d）
- **炎症状态**：IL-1β处理（1 ng/mL）使迁移率激增至32%，并伴随OPN+细胞在软骨界面聚集（图5e）
- **机械调控**：施加0.5 kPa压缩力（相当于体重3倍负荷）可增强ALP+细胞在软骨侧的屏障作用

#### 2. 血管-骨互作新机制
- **时间依赖性**：3:2比例的bmMSCs-HUVECs共培养在7天时形成稳定血管网，但14天后出现血管退化
- **细胞通讯**：PDGFRB+细胞在软骨侧占比达18%，其表达量与血管迁移呈负相关（r=-0.72）
- **基质重塑**：血管周围检测到 Nestin+细胞群（5-8个/高倍视野），提示骨前体细胞向血管周细胞转化

### 四、技术优势与转化潜力
#### 1. 系统性能提升
- **空间分辨率**：通过60×40 μm的成像单元，可区分单层细胞（如hACs的细胞核密度达5000个/mm2）
- **通量优势**：每个芯片包含3个独立培养单元，单次实验可完成6组对照（hACs±血管、bmMSCs±炎症因子等）
- **成本控制**：材料成本较传统3D生物打印降低60%，细胞利用率提高至85%

#### 2. 药物筛选新平台
- **靶向分析**：通过移除特定腔室（如仅保留软骨或血管区），可分别评估药物对单一组织的毒性
- **动态给药**：侧向通道支持连续补液，实现梯度刺激（如IL-1β从0.1 ng/mL线性增加至1 ng/mL）
- **疗效评估**：血管迁移指数（VMI）作为核心指标，与OA患者关节镜评分相关性达0.81（p<0.001）

#### 3. 再生医学应用场景
- **组织工程**：成功构建厚度>200 μm的仿生软骨-骨复合体（图2g）
- **支架优化**：通过调节β-Gly浓度（0.5-2.0 mM），可控制骨矿化速度（从7天到21天）
- **免疫治疗**：集成外部腔室可添加Treg细胞或PD-1配体，模拟免疫调节环境

### 五、讨论与未来方向
#### 1. 模型局限性
- **力学限制**：静态培养导致ECM沉积率较动态模型低40%
- **细胞异质性**：bmMSCs来源不同，其骨矿化效率差异可达3倍
- **时间窗口**：超过14天培养出现细胞凋亡（Caspase-3+细胞增加至15%）

#### 2. 潜在改进方向
- **动态加载模块**：集成压电传感器模拟步态压力（0-5 kPa可调）
- **细胞替换系统**：采用磁珠标记实现hACs与bmMSCs的快速替换
- **多组学整合**：通过微流控分室同步收集转录组、蛋白质组和代谢组数据

#### 3. 转化应用前景
- **生物标志物发现**：已鉴定出3个特异性OA标志物（S100A8、YKL40、IL-6R）
- **药物开发**：在平台中完成5个OA候选药物的临床前评估，EC50值误差<15%
- **手术模拟**：3D打印患者特异性模型可预测关节置换术后5年疗效

### 六、总结
该研究建立的"双腔室器官芯片"系统实现了三个突破性进展：
1. **界面可视化**：通过透明介质通道，首次实现了软骨-骨界面血管迁移的实时追踪
2. **动态调控**：模块化设计支持分步干预（软骨→血管→骨），各步骤响应时间缩短至48小时
3. **临床转化**：已与诺华制药合作，完成6个月长期培养的细胞微环境稳定性验证

该平台为解析OA早期病理机制提供了新工具，其模块化设计理念可扩展至其他退行性疾病研究（如骨应力性骨折、痛风性关节炎）。后续研究将重点开发自动化高通量模块，实现1000+样本/日的并行测试能力。