RAB GTPases邻近相互作用网络图谱揭示RAB14在EARP复合物招募与细胞迁移中的新功能

《Communications Biology》：A proximity map of RAB GTPases delineates roles for RAB14 in EARP complex and UHRF1BP1 endosomal recruitments

本研究利用APEX2邻近标记技术系统性绘制了23种人类RAB GTPases的邻近蛋白质组图谱，通过生物信息学分析揭示了RAB GTPases与膜运输相关蛋白的新型功能联系。研究人员发现RAB25通过招募DENND6A至循环内体促进细胞迁移，并首次证实RAB14与EARP复合物相互作用调控内体栓系过程。该研究为探索RAB GTPases新型效应器功能提供了宝贵资源，对理解细胞内运输机制及相关疾病具有重要意义。

　　

在细胞生物学领域，膜运输过程如同精密的城市交通系统，需要多种分子机器协同调控。其中RAB GTPases作为最重要的分子开关之一，通过GTP/GDP循环状态转换调控货物分选、囊泡出芽、运输和融合等关键步骤。然而，由于RAB与效应蛋白的相互作用具有瞬时性特点，全面绘制其相互作用网络一直面临巨大挑战。

近年来，邻近标记技术的出现为破解这一难题提供了新思路。APEX2作为一种高效的邻近标记酶，能在过氧化氢刺激下对靶蛋白周围10-20纳米范围内的蛋白质进行共价标记，为捕捉瞬时相互作用提供了独特优势。尽管已有研究对部分RAB蛋白进行相互作用组学分析，但系统性绘制RAB家族蛋白的邻近相互作用图谱仍具有重要意义。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，Véronique Gaudreault等研究人员构建了包含23种人类RAB GTPases的APEX2融合蛋白库，通过大规模质谱分析建立了全面的RAB邻近相互作用网络。研究不仅验证了已知的RAB调控关系，还发现了多个新型功能联系，特别是揭示了RAB14在EARP复合物招募和细胞迁移中的新功能。

研究人员主要采用APEX2介导的邻近标记技术结合质谱分析，构建了23种RAB GTPases的邻近蛋白质组图谱。通过Flp-in T-Rex稳定细胞系表达系统，使用可诱导表达载体控制APEX2:RAB融合蛋白的表达水平。采用SAINT算法进行统计学富集分析，筛选高置信度的相互作用蛋白。利用CRISPR/Cas9技术构建基因敲除细胞系，通过免疫共沉淀、邻近连接 assay和免疫荧光等技术验证蛋白质相互作用。细胞迁移实验采用伤口愈合 assay，图像分析使用CellProfiler软件进行自动化定量。

大多数APEX2:RABs定位于预期位点并能生物素化邻近蛋白

研究人员成功构建了24种人RAB GTPases的APEX2融合蛋白，其中23种能够稳定表达。免疫荧光分析证实大多数APEX2:RABs定位于预期的细胞器区域，如RAB1A和RAB2A主要位于高尔基体，而RAB35富集于质膜。加入生物素酚和H₂O₂处理后，多数APEX2:RABs能够有效标记邻近蛋白质，表明该细胞系库适用于大规模质谱分析。

APEX2:RAB邻近蛋白与膜运输过程相关

质谱分析共鉴定到大量RAB邻近蛋白，不同RAB的邻近蛋白数量存在显著差异。早期内体相关RABs平均鉴定到1087个显著富集的邻近蛋白，而晚期内体RABs平均仅为35个。基因本体(GO)富集分析显示，大多数RAB数据集显著富集膜运输相关术语，证实了数据的生物学相关性。与既往研究比较发现，本数据集与其它BioID研究重叠度最高，特别是与线粒体定位的RAB相互作用组研究有35%的重叠。

已知RAB调控因子可被检测并发现新关系

通过特异性评分(WD score)和相对丰度分析，研究人员成功识别了已知的RAB-GEF和RAB-GAP对，如RAB21与其GEF VARP的相互作用。同时发现了新型关系，如RAB25与ALS2(一种RAB5 GEF)的相互作用。点图分析显示DENND6A(一种RAB14 GEF)与RAB14具有最高特异性，同时与RAB25也存在显著富集。

RAB25与ALS2相互作用并与DENND6A功能协同调控细胞迁移

研究发现RAB25与ALS2存在物理相互作用，免疫共沉淀证实野生型和L71Q突变型RAB25均能与ALS2结合。值得注意的是，RAB25与DENND6A在细胞内点状结构中共定位，且这种相互作用依赖于RAB25的GTP结合状态。功能实验表明，RAB25过表达促进MDA-MB-231细胞迁移，而DENND6A敲低可逆转此效应，提示二者在调控细胞迁移中存在功能联系。

RAB25招募DENND6A至循环内体

共定位分析显示，DENND6A单独表达时分布于多种细胞器，而与RAB25共表达时显著富集于RAB11阳性的循环内体。RAB14敲低部分减弱但未完全消除DENND6A向循环内体的招募，表明RAB25足以促进但非DENND6A内体招募所必需。这种招募模式在MCF7、MDA-MB-231和HeLa细胞中均得到验证，表明RAB25-DENND6A相互作用具有普适性。

运输复合物在RAB GTPases邻近蛋白质组中的富集提示RAB14与EARP复合物的相互作用

膜运输复合物分析显示，EARP复合物与RAB4、RAB25和RAB14均存在邻近关系，其中与RAB14的相对丰度最高。DepMap遗传相关性分析进一步支持了RAB14与EARP复合物的功能联系。免疫共沉淀和邻近连接实验证实RAB14与EARP特异性亚基VPS50的相互作用强于GARP特异性亚基VPS54，且内源性VPS50能共沉淀内源性RAB14。

RAB14调控EARP内体招募并影响SNARE定位

RAB14敲除导致VPS50在细胞内分散，其与转铁蛋白受体的共定位显著降低，而不影响VPS54的高尔基体定位。进一步研究发现，RAB14、EARP(VPS50)和TSSC1敲除均导致VAMP3阳性内体管状结构减少，且Syntaxin 6与CI-MPR受体的共定位受损，表明RAB14通过EARP复合物调控内体栓系和SNARE蛋白定位。

RAB14最富集相互作用蛋白分析揭示其调控SHIP164及其直系同源物UHRF1BP1定位的作用

RAB14特异性相互作用蛋白中，脂质转运蛋白SHIP164/UHRF1BP1L富集程度最高。免疫共沉淀证实RAB14与SHIP164及其直系同源物UHRF1BP1均存在相互作用。UHRF1BP1与激活型RAB14在点状结构中高度共定位，且RAB14、EARP和TSSC1敲除影响UHRF1BP1与反式高尔基体标记物TGN46的共定位，提示RAB14通过EARP依赖性机制调控UHRF1BP1定位。

本研究成功构建了迄今为止最全面的RAB GTPases邻近相互作用网络，揭示了多个新型功能关系。特别是阐明了RAB25-DENND6A在细胞迁移中的协同作用，以及RAB14-EARP复合物在内体运输中的调控机制。这些发现不仅深化了对RAB GTPases功能多样性的理解，也为研究膜运输异常相关疾病提供了新视角。

该研究的局限性包括使用异位表达的APEX2标记蛋白，虽多数定位于正确位置，但未完全验证其功能互补性。此外，APEX2标记所需的H₂O₂处理可能引入氧化应激干扰。未来采用更先进的邻近标记技术如TurboID可能进一步提高数据质量。

尽管存在这些限制，本研究提供的RAB邻近相互作用图谱作为宝贵资源，将促进领域内对RAB GTPases新型效应器的发现和功能表征。通过整合结构预测、共表达等多元数据，这一数据集有望揭示更多RAB调控网络的精细机制。