基于单目标光片显微镜的快速三维荧光寿命成像技术实现多细胞系统功能研究新突破

《Communications Biology》：Fast volumetric fluorescence lifetime imaging of multicellular systems using single-objective light-sheet microscopy

本研究针对传统共聚焦荧光寿命成像（FLIM）在活体样本应用中存在的速度慢、光毒性强等问题，开发了将单目标光片显微镜（soSPIM）与新型SPAD阵列探测器相结合的soSPIM-FLIM技术。该技术实现了较先进共聚焦FLIM快10-100倍的成像速度（单帧可达100毫秒），并在活胚胎类器官的三维寿命多重成像和膜张力动态监测中展现出卓越性能，为活体多细胞系统的功能研究提供了强大工具。

　　

在生物医学研究领域，科学家们一直渴望能够"看清"生命活动的动态过程，尤其是多细胞系统如胚胎发育、器官形成等复杂生物学事件。荧光寿命成像（FLIM）作为一种强大的光学成像技术，能够通过测量荧光分子的寿命来获取超越强度的功能信息，如分子环境、代谢状态、蛋白质相互作用等。然而，传统共聚焦FLIM技术在活体样本应用中面临严峻挑战：成像速度慢导致无法捕捉快速动态过程，而高激光功率又可能对敏感样本造成光损伤。

这些限制严重阻碍了FLIM技术在活体研究中的应用，特别是在对光敏感、快速变化的胚胎和类器官等三维样本中。虽然光片显微镜以其高速、低光毒性的特点成为活体成像的理想选择，但将其与FLIM结合一直存在技术瓶颈，主要是缺乏适合宽场成像的纳秒时间分辨探测器。

近期，由Valentin Dunsing-Eichenauer和Johan Hummert共同领导的研究团队在《Communications Biology》上发表了一项突破性研究，他们成功将单目标光片显微镜（soSPIM）与新型SPAD阵列探测器相结合，开发出soSPIM-FLIM技术，实现了对多细胞系统的快速三维荧光寿命成像。

为开展这项研究，研究人员主要采用了几个关键技术方法：首先是搭建了定制化的单目标光片显微镜系统，配备新型脉冲激光器和512x512像素的SPAD阵列探测器；其次建立了两种光片模式（扫描和静态）的性能对比体系；然后利用小鼠胚胎类器官（gastruloids）作为模型系统，通过免疫荧光标记和荧光张力探针（Flipper-TR）进行方法验证；最后开发了专门的数据处理流程，包括仪器响应函数表征、堆积效应校正、寿命拟合算法和双照明图像融合等。

Benchmarking of soSPIM-FLIM in 3D embryonic organoids

研究人员首先对soSPIM-FLIM性能进行了系统评估。他们以固定的小鼠胚胎类器官E-cadherin-AF488染色样本为模型，对比了soSPIM-FLIM（扫描和静态光片模式）与共聚焦FLIM（传统和快速FLIM）的性能差异。结果表明，soSPIM-FLIM在成像速度上具有显著优势：静态光片模式仅需100毫秒即可获得高质量的FLIM图像，比快速共聚焦FLIM快10倍以上，而光子计数率更是高出两个数量级。重要的是，测量得到的荧光寿命值与共聚焦FLIM结果高度一致，证明了技术的准确性。

Volumetric(dual-illumination) soSPIM-FLIM in embryonic organoids

针对三维成像需求，研究团队评估了soSPIM-FLIM在80微米深度范围内的体积成像能力。研究发现，虽然共聚焦显微镜在轴向分辨率方面略有优势，但soSPIM-FLIM在深层组织中的信号衰减更小。特别值得注意的是，扫描光片模式在深层组织中图像质量更优，而静态光片模式在成像速度方面更具优势。为了解决光片传播过程中的图像质量衰减问题，研究人员还开发了双照明技术，通过从两个相对方向依次照明样本并融合图像，获得了质量更均匀的三维FLIM图像。

Application of soSPIM-FLIM for lifetime multiplexed light-sheet imaging

荧光寿命多重成像是FLIM的重要应用之一，可以同时区分光谱重叠但寿命不同的荧光探针。研究团队在表达核定位H2B-GFP的活胚胎类器官中，加入了膜张力传感器Flipper-TR，这两个探针的激发光谱相似但寿命特征不同。通过soSPIM-FLIM技术，研究人员成功在三维空间内区分了细胞核（GFP）和细胞膜（Flipper-TR）信号，无需序列成像或复杂的光学设置。相位图分析和双指数拟合结果显示，GFP的寿命组分为2.1±0.2纳秒和5.4±0.9纳秒，而Flipper-TR为1.0±0.2纳秒和4.8±0.2纳秒，与共聚焦FLIM结果高度一致。

Application of soSPIM-FLIM for live volumetric time-lapse membrane tension imaging in organoids

最能体现soSPIM-FLIM技术优势的是其在活体样本长时间动态监测中的应用。研究人员对Flipper-TR染色的活胚胎类器官进行了长达45分钟的三维时间序列FLIM成像，成功监测了单个细胞水平的膜张力动态变化。研究发现，Flipper-TR的长寿命组分（约5.0纳秒）随时间逐渐降低，这可能与膜张力变化相关。有趣的是，这种变化在较高激光功率下更为明显，提示可能存在光照诱导的探针光敏化效应。尽管如此，研究证明soSPIM-FLIM能够以每秒数个体积的速度，在单细胞水平可靠地追踪几百皮秒级别的寿命变化。

研究结论和讨论部分强调了soSPIM-FLIM技术的重大突破意义。该工作首次实现了快速、光学切片的三维宽场荧光寿命成像，将FLIM的成像速度提升了10-100倍，同时大幅降低了光毒性。研究人员系统比较了扫描和静态两种光片照明模式的优劣，为不同应用场景下的技术选择提供了指导。扫描光片模式在深层组织成像质量方面更优，而静态光片模式在速度和动态范围方面更具优势。

这种技术突破为生命科学研究开辟了新的可能性。soSPIM-FLIM不仅大幅加速了FLIM成像，更重要的是为光片显微镜提供了超越荧光强度的定量读出能力。研究人员预计，该技术将广泛应用于目前仅限于二维FLIM成像的动态多细胞系统研究，如通过FLIM-FRET（荧光共振能量转移）生成三维分子力和蛋白质相互作用图谱，通过寿命标记的无标记成像研究代谢梯度，或通过FLIM传感器监测氧、钙等离子浓度变化。应用于活体生物和日益增长的类器官模型，这种方法有望成为推动我们对健康和疾病状态下生理学理解的关键工具。

值得注意的是，soSPIM-FLIM使用的峰值照明功率比共聚焦FLIM低数个数量级，这对光敏感样本的长期存活至关重要。结合最近报道的高通量三维成像流程，soSPIM-FLIM可以实现自动化高通量三维FLIM成像，每小时约50个类器官的吞吐量。虽然本研究侧重于soSPIM几何结构，但该实现与其它单目标或多目标光片配置完全兼容，只要能够实现足够的光收集效率即可。

未来，将高速OPM（ oblique plane microscopy，斜面显微镜）成像与时间门控探测相结合，有望实现每秒超过1个体积的FLIM成像速率，用于动态亚细胞过程研究。同时，需要在不同样本、荧光团和实验条件下进一步评估样本在长时间脉冲照明下的存活能力。

总体而言，光片FLIM不仅大幅加速了FLIM成像，更重要的是为光片显微镜提供了超越荧光强度的定量读出能力，有望在动态多细胞系统研究中发挥重要作用，推动我们对复杂生命过程的深入理解。