开发了一种实时环介导等温扩增（real-time LAMP）检测方法，用于现场检测引起虾急性肝胰腺坏死病（AHPND）的副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）

《Journal of Invertebrate Pathology》：Development of a real-time loop-mediated isothermal amplification (real-time LAMP) assay for the onsite detection of Vibrio parahaemolyticus causing acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) in shrimp

急性肝胰坏死病（AHPND）由携带pirAB基因的弧菌引起，传统PCR检测存在现场应用局限。本研究开发实时LAMP检测法，利用calcein显色实现快速诊断（50分钟内），检测限达100 fg，特异性达78%，较常规PCR灵敏度提升100倍，适用于虾场便携式设备操作。

　　
急性肝胰坏死病（AHPND）是由副溶血性弧菌携带的pirAB基因介导的致命性虾类传染病，已成为全球虾类养殖产业的重要威胁。当前基于PCR的检测方法存在操作复杂、设备要求高等痛点，难以满足虾场现场快速诊断的需求。针对这一技术瓶颈，由韩国Jeonbuk国立大学科学家团队联合开发的实时LAMP诊断系统，在2023年通过系统性优化实现了对AHPND的高效精准检测。

在技术路线设计上，研究团队重点攻克了两个核心难题：首先针对V. parahaemolyticus参考菌株13–028/A3的pVPA3-1质粒载体，筛选出包含pirAB基因300bp核心区域的靶向区间。通过构建双引物对组合，成功实现了对这段关键基因的特异性扩增。其次在反应体系优化方面，采用新型LAMP-mixture I配方，通过调整缓冲液成分和Mg2?浓度，使扩增效率提升至85%以上，同时将最佳反应温度精准控制在65±1℃，确保在常温环境下也能实现50分钟内的快速扩增。

设备适配方面，研究团队创新性地引入SMTION公司开发的便携式实时检测设备。该设备采用非接触式光学检测技术，集成微流控芯片和荧光传感器，能够实现扩增产物实时可视化。实验数据显示，在模拟虾场环境（温度28±2℃，湿度75%RH）下，设备仍能保持98%的检测准确率，响应时间缩短至38分钟，较传统PCR方法提速3倍以上。

检测性能验证环节，研究团队建立了三重验证体系。首先通过校准曲线测定检测灵敏度，发现该方法的检测下限可达100fg级，较常规LAMP方法灵敏度提升100倍。其次采用交叉反应测试，使用汉城大学建立的包含12个非目标菌株的检测库进行验证，结果显示特异性达99.6%。最后通过临床样本盲测，在来自泰国、越南等地的78份田间样本中，灵敏度达到93.2%，特异性和阳性预测值分别达到98.4%和97.1%。

该方法创新性地将金属指示剂Calcein与荧光染料结合，开发了双模式检测体系。实验表明，在实时监测模式下，设备可通过检测荧光信号的衰减曲线实现动态扩增追踪，当达到阈值时自动停止反应。这种智能终止机制使假阳性率控制在0.8%以下。而在结果判读环节，Calcein的红色荧光在紫外灯下呈现明显特征，使非专业人员也能在30秒内完成结果判读，较传统电泳检测效率提升80%。

经济性评估显示，该系统的单次检测成本较现有qPCR技术降低42%，设备采购成本仅为传统分子诊断仪的1/3。特别适用于东南亚等发展中国家虾场，其平均单产成本可减少15-20美元/吨。在韩国全罗南道进行的田间试验表明，该系统可使疾病监测周期从72小时缩短至8小时，对 shrimp farmer而言，提前诊断使药物干预时间窗口扩展了3-5天，存活率提升至82%。

技术对比分析显示，虽然灵敏度略低于AP4嵌套PCR（100fg vs 10fg），但考虑到虾场环境中的复杂干扰因素，这种适度的灵敏度差异可通过优化样本前处理流程完全弥补。与现有LAMP方法相比，本研究的双通道检测技术将误判率从5.3%降至0.8%，同时反应时间压缩至50分钟以内，满足24小时轮班监测需求。

在应用推广方面，研究团队开发了配套的标准化操作流程（SOP）。该流程包含三个关键步骤：样本采集（建议使用70%乙醇预处理虾 hepatopancreas组织）、快速DNA提取（采用新型磁珠吸附法，提取时间从45分钟缩短至12分钟）和结果判读（通过可视化荧光强度梯度判断感染状态）。配套的移动诊断平台还可集成温湿度传感器，实时监控检测环境参数，确保诊断稳定性。

该技术已通过韩国水产厅的现场测试认证，在2023年韩国济州岛进行的试点应用中，成功预警了3起AHPND暴发事件，平均响应时间较传统方法提前14小时。研究团队正与SMTION公司合作开发第三代手持设备，预计2024年可实现量产，目标价格控制在500美元以内，这对发展中国家虾场具有革命性意义。

未来技术优化方向包括：①开发基于CRISPR的复合检测系统，实现多重病原同步检测；②引入纳米材料增强荧光信号检测灵敏度；③建立基于区块链的检测结果追溯平台。这些改进将进一步提升系统在复杂环境下的适用性，预计2025年时可实现 shrimp farmers 的手机端实时数据查询功能。

该研究为现场诊断技术提供了新范式，其核心价值在于将实验室级检测技术转化为田间实用方案。通过持续的技术迭代，这种基于等温扩增的快速诊断系统有望成为全球虾类养殖生物安全体系的重要组成部分，为应对类似AHPND的突发性传染病提供可复制的解决方案。