靶向TBK1/IKKε介导的RIPK1磷酸化抑制增强肿瘤对免疫细胞杀伤的敏感性

《Cell Death Discovery》：Inhibition of TBK1/IKKε mediated RIPK1 phosphorylation sensitizes tumors to immune cell killing

本研究针对肿瘤对免疫细胞介导的细胞毒性（如免疫检查点阻断疗法）的耐药性问题，通过多组学分析与功能实验，揭示了TBK1/IKKε激酶通过磷酸化RIPK1第25位丝氨酸（S25）维持肿瘤存活的关键机制。研究发现，抑制TBK1/IKKε可阻断RIPK1的生存磷酸化，促进其激活（S166磷酸化），从而增强CD8+ T细胞和NK细胞对黑色素瘤的杀伤效果。该工作为克服肿瘤免疫耐受提供了新靶点，有望提升现有免疫疗法的疗效。

　　

在癌症治疗领域，免疫检查点阻断（ICB）疗法通过激活患者自身的免疫系统来攻击肿瘤，已成为革命性的突破。然而，大多数患者因肿瘤对免疫细胞杀伤的固有抵抗而疗效有限。尤其令人困扰的是，即使免疫细胞（如CD8⁺ T细胞）能浸润肿瘤并释放肿瘤坏死因子（TNF）等细胞因子，肿瘤仍可通过激活内部生存信号逃脱死亡。这种耐药性背后的分子机制尚不明确，成为提升免疫疗法效果的关键瓶颈。

为解决这一难题，Anastasia Piskopou等研究团队在《Cell Death Discovery》上发表了一项研究，聚焦于TNF信号通路中的核心调控蛋白RIPK1。RIPK1如同一个“分子开关”，其活性状态决定细胞在TNF刺激下走向生存或死亡。此前研究发现，某些肿瘤突变可通过依赖RIPK1的方式增强T细胞杀伤，但RIPK1的精准调控机制及其在免疫细胞攻击下的动态变化仍待揭示。本研究通过整合磷酸化蛋白质组学、CRISPR筛选和功能性验证，首次阐明TBK1/IKKε激酶通过磷酸化RIPK1第25位丝氨酸（S25）维持肿瘤存活，而靶向这一机制可显著增强免疫细胞的杀伤效力。

关键技术方法

研究利用健康捐赠者来源的PBMC（外周血单核细胞）分离CD8⁺ T细胞和NK细胞，通过抗原受体工程化构建共培养系统；采用CRISPR-Cas9技术构建基因敲除细胞系（如TRAF2、CYLD、TBK1/IKKε等）；通过生物素标记的TNF刺激与链霉亲和素磁珠富集TNFR1复合物，结合质谱（AP-MS）分析其组成和磷酸化修饰；开发靶向质谱（SRM）方法定量RIPK1磷酸化位点；利用竞争性细胞存活实验和流式细胞术评估免疫细胞杀伤效果。

研究结果

1. 敏感化肿瘤细胞在T细胞攻击下丧失促生存磷酸化事件

通过对比野生型与TRAF2敲除（KO）黑色素瘤细胞在TNF或T细胞共培养下的磷酸化蛋白质组，发现敏感化肿瘤细胞中近90%的磷酸化位点变化与TNF处理高度重叠，且DNA损伤响应通路（如ATM、ATR）被快速激活。进一步时间序列分析显示，耐药细胞在T细胞攻击下能诱导RIPK1 S25和CYLD S418/S422等位点的磷酸化（抑制细胞死亡），而敏感细胞（TRAF2 KO联合Birinapant处理）则丧失该响应。CYLD敲除实验证实其失活可增强肿瘤抵抗性，验证了磷酸化修饰在免疫逃逸中的核心作用。

2. 敏感化肿瘤细胞的TNFR1复合物缺乏非经典IKK激酶

通过TNF刺激后TNFR1复合物的亲和纯化与质谱分析，发现敏感细胞中LUBAC线性泛素化复合物及IKK激酶（包括IKKα/β和TBK1/IKKε）的招募显著减少。相关性分析显示，复合物中蛋白丰度降低与CRISPR筛选中的肿瘤敏感化基因高度相关。值得注意的是，在多种敏感化模型（如RNF31 KO或HOPIN-8抑制剂处理）中，TBK1/IKKε的缺失是共同特征，表明其招募是维持肿瘤抵抗的关键。

3. 敏感化肿瘤细胞无法抑制TNFR1复合物内RIPK1激活

靶向质谱分析揭示，敏感细胞中RIPK1 S25磷酸化水平显著降低，而代表激活状态的S166磷酸化升高。这种磷酸化失衡在TBK1/IKKε缺失的细胞中尤为明显，且不受经典IKK激酶（IKKα/β）影响，证实TBK1/IKKε是RIPK1 S25磷酸化的主要激酶。

4. 非经典IKK检查点激酶的缺失增强肿瘤对免疫细胞杀伤的敏感性

功能实验表明，TBK1单独敲除或TBK1/IKKε双敲除可显著增强黑色素瘤细胞对CD8⁺ T细胞和NK细胞的敏感性，且该效应特异于TNF通路（对IFN-γ无响应）。TNFR1复合物质谱进一步验证敲除细胞中RIPK1 S25磷酸化缺失及S166磷酸化升高，证实TBK1/IKKε通过直接调控RIPK1磷酸化平衡决定免疫杀伤结局。

结论与意义

本研究系统阐明了肿瘤抵抗T细胞杀伤的一种新机制：TBK1/IKKε激酶通过磷酸化RIPK1 S25维持其非活性状态，从而抑制TNF介导的细胞死亡。干扰这一检查点可促进RIPK1激活，将TNF信号导向凋亡方向。与直接敲除RIPK1的策略相比，靶向TBK1/IKKε不仅能解除生存信号，还保留了RIPK1的促死亡功能，具有更好的治疗潜力。该发现为联合ICB疗法提供了新思路，例如通过开发TBK1/IKKε抑制剂增强免疫细胞杀伤效率。未来需在体内模型中验证其安全性，并深入探索经典与非经典IKK激酶的交互作用。这一研究从分子层面揭示了肿瘤免疫耐受的可塑性机制，为克服临床耐药性提供了理论依据。