一项全基因组siRNA筛选发现了HBV感染中先前未知的病毒因子和抗病毒宿主因子

《Journal of Hepatology》：A genome-wide siRNA screen identifies previously unknown proviral and antiviral host factors in HBV infection

HBV感染依赖宿主因子，研究通过全基因组siRNA筛选结合多层级验证，发现NCOA5和CHD4是促进病毒复制的关键因子，NRAS具有抗病毒作用。机制涉及HNF4α调控病毒转录、cccDNA表观遗传修饰及细胞周期调控。研究成果揭示了HBV宿主互作新机制并为治疗提供靶点。

　　

程晓明|夏宇晨|陈莉|张敏|犬塚忠|Chakka Sirisha|陈泉|滕燕|毛建伟|李晓云|董伟|Karim Mouzannar|Cheng Ken Chih-Chien|梁T.Jake

美国国立卫生研究院（NIH）国家糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所（NIDDK）肝脏疾病分部，贝塞斯达，MD 20814

摘要

背景与目的

乙型肝炎病毒（HBV）广泛利用宿主细胞机制进行有效感染。本研究旨在通过功能基因组学方法全面识别和验证对HBV感染至关重要的宿主因子。

方法

在HepG2-NTCP细胞中进行了全基因组siRNA筛选，使用高通量AlphaLisa检测细胞内HBV核心抗原和e抗原作为读数。选定的基因经过了多层次的验证：通过敲低、过表达和敲除在肝癌细胞系或原代人肝细胞（PHHs）中评估病毒感染/复制；分析21例HBV相关肝细胞癌（HCC）患者的肿瘤/非肿瘤组织中的基因表达；以及使用AAV-HBV小鼠模型进行体内评估。

结果

验证结果显示，核受体共激活因子5（NCOA5）和染色质结构域-解旋酶-DNA结合蛋白4（CHD4）是重要的病毒辅助宿主因子；它们的敲低显著降低了HBV的复制。相反，神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物（NRAS）被鉴定为抗病毒因子。机制上，NCOA5可能通过雌激素受体和肝细胞核因子4α（HNF4α）轴起作用，而CHD4调节cccDNA的组蛋白修饰。NRAS的敲低通过提高HNF4A表达并诱导细胞周期停滞来增强HBV转录，这可能解释了在HBV相关HCC组织中观察到的HBV复制受限现象，因为这些组织中经常发生RAS过度激活。

结论

本研究确定了NCOA5和CHD4作为关键的病毒辅助因子，以及NRAS作为调节HBV复制的强效抗病毒因子。这些发现突显了HBV对宿主的深刻依赖性，揭示了特定的分子机制（涉及HNF4α、cccDNA的表观遗传调控和细胞周期），并发现了潜在的HBV感染治疗策略的宿主靶点。

通俗摘要

乙型肝炎病毒（HBV）需要人类肝细胞机制来感染和复制。我们使用大规模遗传筛选方法找到了帮助或阻止HBV的人类蛋白质。我们发现了两种帮助HBV复制的蛋白质（NCOA5和CHD4），以及一种阻止其复制的蛋白质（NRAS）。我们在人类肝细胞和小鼠中证实了这些发现。了解这些蛋白质如何控制HBV（通过调节病毒转录、修改病毒DNA或影响细胞生长）为开发更好的治疗方法提供了新的靶点。

引言

乙型肝炎病毒（HBV）全球约有2.96亿人慢性感染，导致多种肝脏疾病^[1]。作为一种致癌病毒，HBV在肝细胞中引起基因组和功能改变，从而导致恶性转化^[2]。目前的治疗选择仅限于核苷（NUCs）类似物和干扰素（IFN）。虽然NUCs可以抑制病毒复制，但它们很少能实现功能性治愈（定义为HBsAg消失），并且需要终身治疗。IFN治疗仅使3-8%的患者HBsAg消失，同时会引起显著的不良反应^[3]。因此，HBV相关的肝脏疾病仍然是全球主要的健康挑战，需要新的治疗策略。

HBV是一种有包膜的嗜肝DNA病毒，具有3.2 kb的部分双链环状（rc）DNA基因组，编码六种蛋白质。这种有限的编码能力要求其在整个生命周期中广泛利用宿主因子^[4]。病毒进入需要多个宿主受体的参与，包括肝素硫酸蛋白聚糖（如glypican 5）、牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）和表皮生长因子受体（EGFR），通过clathrin介导的内吞作用^{[5], [6]}。进入细胞后，衣壳运输涉及Rab5A/Rab7A GTP酶和微管，最终通过宿主DNA修复机制将rcDNA导入细胞核并转化为共价闭合的环状DNA（cccDNA）^{[7], [8], [9], [10]}。染色质化的cccDNA小染色体招募肝细胞转录因子，包括肝细胞核因子4α（HNF4α, HNF4A）、视黄醇X受体α（RXRα, RXRA）、过氧化物酶体增殖激活受体α（PPARα, PPARA）等，并经历表观遗传调控以转录病毒RNA^{[10], [11], [12]}。宿主机制将这些蛋白质转化为e（HBeAg）、HBsAg、核心抗原（HBc）、聚合酶和X抗原（HBx）蛋白。3.5 kb的前基因组RNA（pgRNA）作为翻译和逆转录的模板。成熟的核衣壳要么在细胞核中循环以扩增cccDNA，要么在内质网膜上获得包膜^[4]。子代病毒通过多囊泡体释放^[13]。

HBV相互作用的所有宿主因子尚未完全表征。高通量功能基因组学和HBV受体识别的最新进展使得能够全面绘制病毒-宿主相互作用的完整生命周期图谱。我们在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中进行了全基因组siRNA筛选，并同时评估了病毒抗原和细胞活力。这种方法识别了数千个候选调节因子，其中大多数之前与HBV无关，许多后来得到了验证，为HBV-宿主相互作用提供了新的见解，并可能带来新的治疗策略。

材料与方法

详细的“材料与方法”信息见补充资料。

全基因组siRNA筛选识别调节HBV感染的宿主因子

我们建立了一个高通量AlphaLISA平台用于检测HBeAg。优化后的检测方法使用重组HBeAg显示出宽动态范围（图S1A）。由于使用了整个细胞裂解物以及HBcAg和HBeAg之间的序列同源性，AlphaLISA可能同时检测到这两种病毒蛋白。在HBV感染的HepG2-NTCP细胞中的验证显示，敲低NTCP后AlphaLISA信号减弱（图S1B），证实了该检测方法对病毒感染的干扰具有鲁棒性。

讨论

高通量功能基因组学方法，包括RNAi敲低和CRISPR/Cas9敲除，已经成功确定了多种病毒（例如SARS-CoV-2、HIV、流感、HCV）的宿主依赖因子^[31]。之前的HBV筛选采用了功能获得策略或复制子模型，识别出如CDKN2C和ZCCHC14等因子^{[32], [33]}。虽然CRISPR/Cas9减少了脱靶效应，并且通常通过完全基因删除产生更强的表型，但它本质上排除了

作者贡献：

X.C.和T.J.L.设计了研究；X.C.、Y.X.、C.L.、M.Z.、T.I.、S.C.、Q.C.、Y.T.、J.M.、X.L.和K.M.进行了研究；W.D.收集了患者样本；K.C.C.、Y.X.、X.C.和T.J.L.分析了数据；X.C.和T.J.L.撰写了论文。

数据可用性声明：

本研究生成的数据可在正文中或补充材料中找到。主要筛选数据可向[e-mail]索取，其他主要实验数据可向[e-mail]索取。

财务支持声明：

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）国家糖尿病、消化系统疾病和肾脏疾病研究所的内部研究计划（资助T.J.L.）以及中国国家自然科学基金（资助X.C.，项目编号82572555）和新兴及重大传染病防控-国家科技重大专项（资助X.C., 项目编号2025ZD01906700）的支持。

利益冲突声明：

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢NIH国家心肺血液研究所的流式细胞术核心设施提供的细胞周期分析支持。