TDP1H493R（SCAN1）与TDP1H263A突变通过阻断转录相关TOP1诱导的双链断裂修复驱动神经退行性病变

《Cell Death & Disease》：H263A and SCAN1/H493R mutant TDP1 block TOP1-induced double-strand break repair during gene transcription in quiescent cells and promote cell death

本研究针对遗传性神经退行性疾病SCAN1的致病突变TDP1H493R及催化失活突变TDP1H263A，系统解析了其在静息细胞中对拓扑异构酶1（TOP1）诱导的DNA双链断裂（DSB）修复的影响。研究发现，TDP1H493R通过共价捕获于DNA末端完全阻断DSB修复，而TDP1H263A通过持久结合TOP1切割复合物（TOP1cc）干扰修复进程，二者均显著加剧基因组不稳定性与细胞死亡。研究首次揭示TDP2可补偿TDP1缺失下的DSB修复，但无法逆转突变型TDP1造成的修复阻滞，为SCAN1等DNA单链断裂修复缺陷相关神经病理机制提供了新视角。

　　

在人类细胞中，DNA拓扑异构酶1（TOP1）是缓解转录和复制过程中DNA超螺旋应力的关键酶。其通过形成短暂的TOP1切割复合物（TOP1cc）催化DNA单链断裂（SSB）的生成与重连。然而，当TOP1cc因DNA损伤或抗癌药物（如喜树碱CPT）作用而稳定存在时，会形成“流产性TOP1cc”，进而阻碍DNA代谢进程。这些病变若未被及时修复，可能在转录过程中转化为更具细胞毒性的DNA双链断裂（DSB），成为基因组不稳定的潜在来源。

酪氨酰-DNA磷酸二酯酶1（TDP1）是修复TOP1cc的核心酶，通过其保守组氨酸H263和H493的协同作用水解TOP1与DNA的磷酸酪氨酸键。SCAN1（1型轴索神经病伴脊髓小脑性共济失调）是一种由TDP1基因纯合突变H493R引起的罕见神经退行性疾病。尽管TDP1缺失会延迟TOP1诱导的DSB修复，但SCAN1突变在静息细胞中如何影响DSB修复及其与神经病理的关联尚不明确。此外，TDP1催化失活突变H263A的效应亦未在静息模型中系统评估。

为此，研究团队利用hTERT永生化视网膜色素上皮（RPE-1）细胞模型，通过血清饥饿诱导细胞周期停滞于G₀/G₁期，模拟神经元等有丝分裂后细胞的状态。在TDP1^-/-细胞中诱导表达野生型TDP1、TDP1^H263A或TDP1^H493R，并采用CPT诱导转录相关的TOP1-DSB。通过53BP1/yH2AX焦点计数、中性彗星实验、染色体提前凝聚（PCC）等技术直接量化DSB形成与修复效率。

关键实验技术包括：

1. 1.
   细胞周期同步化与药物处理：通过接触抑制与血清饥饿使RPE-1细胞停滞于G₀/G₁期，CPT诱导TOP1cc形成。
2. 2.
   DNA损伤应答分析：免疫荧光检测53BP1/yH2AX焦点，中性彗星实验直接检测DSB。
3. 3.
   酶-DNA共价复合物检测：ICE（体内酶复合物）实验分析TOP1cc与TDP1-DNA捕获物。
4. 4.
   基因组稳定性评估：染色体荧光原位杂交（FISH）与染色体断裂/易位计数。
5. 5.
   细胞存活能力测试：克隆形成实验评估CPT长期毒性。

TDP1^H493R与TDP1^H263A在静息细胞中阻断TOP1诱导的DSB修复

在TDP1^-/-细胞中表达野生型TDP1可有效修复CPT诱导的DSB，而TDP1^H493R则完全阻断修复进程，24小时后DSB仍持续存在。TDP1^H263A虽未显示共价捕获，但通过中性彗星实验与PCC均证实其导致DSB修复严重延迟。值得注意的是，RNA聚合酶II延伸抑制剂DRB预处理可显著减少DSB形成，表明该过程依赖转录活性。

TDP1^H493R共价捕获于DNA并阻碍修复

ICE实验显示，TDP1^H493R在CPT处理后形成显著的DNA-TDP1共价复合物，且该捕获在DRB预处理后消失，进一步证实其与转录活性相关。修复24小时后，捕获复合物仍部分残留，提示其半衰期较长。相反，TDP1^H263A细胞积累大量TOP1cc但无TDP1捕获，表明其通过非共价方式干扰修复。

TDP1^H493R与TDP1^H263A为隐性突变

在TDP1^+/+细胞中过表达TDP1^H493R未引起DSB修复缺陷或TDP1捕获，说明野生型TDP1可抑制突变体毒性，符合SCAN1的隐性遗传特征。TDP1^H263A在野生型背景下仅轻度增加DSB积累，但其修复动力学无显著改变，支持其隐性性质。

TDP2补偿TDP1缺失的功能

在TDP1^-/-细胞中敲低TDP2会加剧DSB修复缺陷与TOP1cc积累，表明TDP2在TDP1缺失时可作为备用修复途径。然而，TDP2无法逆转TDP1^H493R或TDP1^H263A导致的修复阻滞，提示突变体TDP1可能竞争性抑制TDP2功能。

突变体促进基因组不稳定性与细胞死亡

TDP1^H493R与TDP1^H263A表达均显著增加CPT诱导的染色体易位频率，且克隆形成实验显示二者加剧静息细胞死亡。DRB预处理可逆转该毒性，证实转录相关TOP1-DSB是核心致病因素。值得注意的是，TDP1^H263A的基因毒性强于TDP1^H493R，可能与TOP1cc的持续积累相关。

本研究系统阐明了SCAN1相关突变TDP1^H493R与催化失活突变TDP1^H263A在静息细胞中通过截然不同的机制阻断TOP1-DSB修复：前者形成持久性DNA-TDP1共价复合物，后者通过非共价结合TOP1cc干扰修复进程。二者均导致错误修复途径激活，引发染色体易位与细胞死亡。研究还明确了TDP2在TDP1缺失时的备份作用，但其无法克服突变型TDP1的显性负效应。这些发现不仅揭示了TOP1诱导的DSB在SCAN1病理中的核心作用，还为其他SSB修复缺陷相关神经退行性疾病提供了机制借鉴。该成果发表于《Cell Death and Disease》，凸显了转录相关DNA损伤修复在维持神经元基因组稳定性中的关键意义。