综述：解码视网膜色素变性：以pre-mRNA剪接为重点的分子靶点与治疗

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Decoding retinitis pigmentosa: molecular targets and therapy with focus on pre-mRNA splicing

本综述聚焦于由剪接因子突变引发的视网膜色素变性（RP），深入探讨了其组织特异性分子机制。文章系统评述了从细胞模型、动物模型到视网膜类器官（RO）的研究进展，揭示了年龄相关性剪接体功能下降与tri-snRNP（U4/U6·U5三小核核糖核蛋白）丰度降低是导致视网膜光感受器易损性的关键。同时，综述全面梳理了基因疗法（如rAAV）、反义寡核苷酸（ASO）及细胞移植等前沿治疗策略的潜力与挑战，为开发靶向性疗法提供了重要见解。

　　

动物模型在研究剪接相关RP中的应用

为了探究剪接突变对视网膜细胞的影响，研究人员开发了多种动物模型。早期的研究集中在培养细胞中表达突变蛋白，这些实验展示了剪接蛋白突变如何影响视网膜功能，但未能深入解释视网膜细胞为何对这些突变特别脆弱。因此，需要更复杂的动物模型来研究RP。

在线虫（C. elegans）中，下调或突变PRPF8和SNRNP200会导致发育缺陷，但未能充分模拟人类视网膜特异性表型。类似地，在果蝇（D. melanogaster）中表达其PRPF8同源基因的九个RP相关变异体也引起了发育缺陷，其中两个致病性突变（dPrp8^S>F/hPRPF8^S2178F 和 dPrp8^H>R/hPRPF8^H3169R）对眼部形态产生了负面影响。这些非脊椎动物模型维护成本相对较低，且表型明确，使其成为进行大规模筛选以识别剪接因子耗竭或突变的遗传或化学调节剂的理想平台。

对具有与人眼相似眼腔的脊椎动物模型的研究，已在斑马鱼（D. rerio）中建立了许多视网膜变性模型，但关注剪接因子的研究较少。早期的斑马鱼研究依赖于下调剪接因子，结果不一。例如，降低PRPF3的表达并未引起明显的眼部异常；然而，沉默Prpf31、Prpf4和Snrnp200则对光感受器结构和视觉功能产生了负面影响。与此一致的是，Prpf4的突变通过可能破坏Wnt信号通路，导致了细胞死亡和神经发育缺陷。在斑马鱼中表达RP相关的PRPF31突变体显示，C端截短的PRPF31（称为SP117，对应人类c.769insA）和AD5（对应人类c.1115_1125 del）变异体导致蛋白不稳定和胞质错误定位。在人类PRPF31^A216P变异体中也观察到了快速的降解和胞质定位。进一步的研究揭示，PRPF31的耗竭会影响具有弱剪接位点的外显子的剪接，并降低斑马鱼视网膜祖细胞的活力和增殖能力。耗竭U2 snRNP特异性蛋白SF3B4进一步证明了剪接机制对斑马鱼视网膜发育的重要性。然而，需要指出的是，人类SF3B4单倍剂量不足与Nager综合征（一种以上肢和面部-下颌缺陷为特征的肢端面部发育不全）相关，而非RP。虽然斑马鱼模型成功模拟了剪接机制破坏引起的视网膜变性，但未能揭示一致的疾病分子机制。

最后，RP研究也使用了小鼠模型。最初的尝试涉及删除PRPF3和PRPF31基因的一个等位基因，以测试剪接因子的单倍剂量不足是否会导致视网膜营养不良。虽然早期报告未观察到任何视网膜表型，但后续研究表明一岁小鼠的视网膜色素上皮（RPE）出现了变性。同一研究报道，表达模拟RP相关替换PRPF3^T494M或PRPF8^H2309P的蛋白变异体后，也出现了RPE缺陷。这些数据表明，至少在小鼠中，RPE是RP突变的主要靶点，而受损的吞噬作用是其缺陷的基础。进一步研究揭示了PRPF31^A216P在RPE胞质中的人工聚集，这与之前在斑马鱼和人类细胞培养中的研究一致。然而，对PRPF8基因中两个模拟RP突变（Y2334N替换和C端延伸E2331VfsX15）的分析并未显示任何视网膜表型，但当这两个Prpf8突变体以纯合子形式表达时，均显示出小脑颗粒神经元的显著变性。

因此，尽管有新的发现和对RP理解的进展，动物模型尚未（完全）就剪接因子突变引起的RP的组织特异性和分子机制提供明确的答案。

视网膜类器官

动物模型为RP的病理生理学提供了宝贵的见解。然而，它们未能重现人类中观察到的所有疾病表型。这主要是因为动物模型中的同源基因表达存在差异，且小鼠或斑马鱼的视网膜生理结构与人类不同。在某些情况下，突变表型甚至不出现在视网膜中。为了克服这些局限性，源自人类诱导多能干细胞（iPSCs）的3D视网膜类器官（RO）显示出作为体外替代模型的潜力。

人类iPSCs可以从患者体细胞重编程获得，并具有分化为对RP研究重要的多种细胞类型的巨大潜力，如RPE、视网膜祖细胞、视网膜神经节细胞和RO。RO类似于人类视网膜，包含视网膜特异性细胞，包括视杆细胞、视锥细胞、 Müller细胞、无长突细胞、双极细胞和神经节细胞。因此，它们已被用于研究眼部发育以及RP进展。此外，RO可以大规模生产且不引起伦理问题。自2011年从小鼠胚胎干细胞首次成功培养，随后于2012年从人类胚胎干细胞，以及2014年从人类iPSC培养成功以来，多个研究组已利用该模型研究RP和其他视网膜病变。迄今为止，RP-RO模型已用于研究数种RP突变。PDE6B和CRB1的突变重现了光感受器缺陷；含有3类RHO突变的RO显示出视杆光感受器错误定位和视紫红质表达减少。RP2缺陷的RO中光感受器分化和成熟受损，导致光感受器细胞死亡。源自突变USH2A的RO表现出RP特有的早期发育缺陷。通过CRISPR-Cas9纠正RPGR突变的患者来源iPSCs产生的RO，恢复了视网膜类器官的结构和功能。含有ARL3突变的RO揭示了多种蛋白因子的错误定位，表明光感受器中蛋白运输存在缺陷。除少数例外，人类RO能够模拟疾病表型，并作为研究各种视网膜病变的有效模型。

RO也被用于研究与剪接因子相关的RP连锁突变。从携带不同PRPF31突变的患者的iPSCs分化出RPE和RO。对患者iPSC分化的RPE和RO进行的转录组分析揭示了剪接体关键组分以及富集于细胞连接、微管和中心粒组织的基因的剪接缺陷。这与形态学变化相关，包括微绒毛和纤毛变短、细胞非极化、细胞连接丧失以及吞噬作用缺陷。PRPF31表达降低导致RPE和RO缺陷，而通过过表达PRPF31可以挽救这些缺陷，表明低水平的PRPF31蛋白是引起RP表型的原因。最近，利用携带PRPF8 p.H2309P突变的患者的iPSCs产生了RPE和RO。突变RPE细胞呈现非极化状态并表现出纤毛缺陷，而RO则显示变性和光感受器数量减少。

RO不仅被证明在表征RP方面有用，还被用于测试各种治疗策略。针对患有RHO-CNV单等位基因突变的患者来源类器官，使用小分子光调节素3（photoregulin3）进行处理，恢复了视杆光感受器内外段中RHO的定位。RP-RO模型也被广泛用于测试基因疗法。最近，干细胞替代疗法在治疗视网膜营养不良方面越来越受欢迎，RO在这一过程中发挥着至关重要的作用。

使用RO建模和治疗视网膜疾病面临若干挑战。即使是源自健康细胞的RO，也由于外节盘发育不全而表现出有限的光反应性。神经视网膜与负责支持光感受器的RPE之间的接触在RO中是缺失的。此外，由于缺乏与大脑靶点的连接，视网膜神经节细胞在类器官内倾向于退化，这阻碍了功能性回路的形成。进一步的并发症包括高度的细胞异质性、不均匀的成熟度和不一致的分层，使得比较和治疗评估变得困难。最后，获得完全成熟的光感受器需要至少6个月的RO培养时间，这使其成为测试潜在疗法的次优模型。

RP的分子机制

许多研究人员正试图理解为何普遍存在的剪接因子突变会导致组织特异性表型背后的分子机制。这一努力既出于理解疾病原理的好奇心，也对寻找治疗方法至关重要。该领域存在两个关键问题：1. 为什么视网膜对剪接因子突变特别脆弱？2. 剪接因子突变如何引发视网膜变性？

光感受器的高代谢活性和外节的持续更新表明它们对剪接因子有很高的需求，使得剪接机器的任何破坏对它们都至关重要。这一观点得到了以下发现的支持：视网膜表达的剪接体snRNA量高于其他测试组织，并且剪接蛋白的突变降低了具有剪接能力的复合物水平，从而导致剪接缺陷。然而，PRPF31在RPE中的表达高于神经视网膜。此外，这一假说无法解释为何RP通常在人二三十岁时才被诊断出来。来自小鼠模型和人类视网膜的最新数据揭示了这一差异。首先，在人类中，PRPF31 mRNA的表达降低与年龄相关。此外，在野生型小鼠的小脑和视网膜中观察到剪接因子表达下降，这表明生理性的、与年龄相关的剪接蛋白下降可能使这些组织对剪接体蛋白的突变更加敏感。因此，似乎光感受器并未显著过表达tri-snRNP特异性蛋白，这些蛋白和tri-snRNP复合物的水平可能接近功能阈值。PRPF31表达的变异曾被提出用来解释PRPF31突变的不完全外显，并与负向调控PRPF31转录的转录因子CNOT3的表达相关。然而，最近的研究挑战了这一观点，发现PRPF31与CNOT3表达之间没有相关性。相反，另一项研究将PRPF31表达与其启动子区域MSR1重复元件的数量联系起来。在PRPF8基因突变中也报道了不完全外显，但其机制尚待探索。基于现有数据，剪接因子，特别是具有剪接能力的tri-snRNP的丰度，似乎是导致视网膜细胞对剪接体蛋白突变易感的关键因素。这包括降低特定剪接蛋白表达的突变，以及损害tri-snRNP功能的突变。一种tri-snRNP蛋白的减少通常会导致其他tri-snRNP组分水平的降低，从而有效降低整体tri-snRNP水平。结合视网膜内剪接体蛋白自然的、与年龄相关的下降，这种脆弱性使得光感受器对tri-snRNP组分的突变特别敏感。

为了理解与剪接因子突变相关的缺陷背后的分子机制，已经进行了许多研究。RP突变可疑地聚集在tri-snRNP组分中，表明视网膜细胞对该复合物的缺陷特别脆弱，而U1和U2 snRNP的突变则引起不同的疾病。tri-snRNP在光感受器中是否存在视网膜特异性、不依赖于剪接的功能？到目前为止，尚无明确证据支持这一想法，并且该假说无法解释PRPF8和SNRNP200的突变，这些突变蛋白通常被整合到tri-snRNP和剪接体中。一些替换影响了蛋白质的功能，并可能影响其正确折叠。随后持续激活的未折叠蛋白反应可能引发导致细胞凋亡的持续性应激。然而，该模型未能阐明那些导致转录减少或mRNA降解的RP连锁突变如何引起光感受器死亡，因为在这些情况下并未产生错误折叠的蛋白。寻找剪接因子的视网膜特异性异构体未能获得阳性结果，这表明RP突变主要影响的功能与pre-mRNA剪接有关，大多数研究也集中在这一方面。

最初使用视网膜基因衍生的剪接报告基因的研究表明，剪接因子影响几个视网膜特异性基因和PAX6的剪接。类似地，在人类器官型视网膜培养物中，响应于PRPF31降低，光转导基因的错误剪接也被观察到。对来自不同携带剪接蛋白突变的RP患者的转录组分析揭示了内含子去除效率和选择性剪接的变化。对两个小鼠PRPF8模型的蛋白质组分析显示错误剪接的蛋白没有重叠，但揭示了环状RNA（circRNA）的共同错误剪接，而circRNA在神经组织中高表达。然而，目前尚不清楚circRNA的变化是剪接机制缺陷的标志，还是circRNA的错误表达直接导致细胞死亡。两项分析患者iPSC来源的RPE和视网膜类器官中RNA剪接的研究，均强调了纤毛组装和维护所必需基因的剪接改变。一致地，他们观察到纤毛形态缺陷和光感受器变性。详细分析表明，具有非典型序列特征的内含子对剪接机制的突变特别敏感。功能分析支持了以剪接为中心的分子病因观点：SNRNP200解旋酶结构域的突变损害其U4/U6解链和剪接体激活，PRPF8的突变影响剪接动力学。此外，使用剪接抑制剂E7107抑制剪接会导致受试者视力丧失。然而，尽管付出了巨大努力，究竟是哪些基因的错误剪接导致视网膜变性仍然是个谜，尽管参与纤毛结构和视觉信号转导的基因是强有力的候选者。虽然尚未确定单个明确的致病性转录本，但在不同患者来源的具有剪接因子突变的细胞中观察到IFT122（对鞭毛内运输至关重要）的错误剪接和circRNA的错误表达，表明存在一组共同的敏感基因。

我们总结当前关于剪接蛋白突变导致RP的研究。统一的原则是与年龄相关的几种剪接机制关键组分下降，与tri-snRNP因子的致病性突变相结合，产生了致命的组合。剪接体活性降低影响众多基因的剪接，包括那些参与纤毛结构和视觉信号转导的基因。这创造了一个向下的螺旋，最终以视网膜细胞死亡告终。一致地，许多尝试治疗由剪接蛋白致病性变异引起的RP的试验都集中在增强视网膜中剪接蛋白的表达上。

RP的潜在疗法

已经测试了多种方法来对抗视网膜疾病，包括使用重组腺相关病毒（rAAV）的基因替代疗法、反义寡核苷酸（ASO）、siRNAs、CRISPR-Cas9基因组编辑以及通过将视网膜细胞引入患者眼内的干细胞替代疗法。此外，还探索了各种小分子用于治疗或减缓RP进展。这些试验涉及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸、维生素A与叶黄素组合、二十二碳六烯酸、维生素E、丙戊酸、叶酸类似物，或更特异的小分子EA2353，其旨在特异性激活视网膜干细胞和祖细胞。下面讨论所选治疗策略的细节。

基因治疗

在过去30年中，通过引入功能性基因产物来挽救突变基因的研究取得了显著进展。这项技术已被证明在治疗几种先前无法治疗的遗传性疾病方面有效。与通常靶向蛋白质的传统药物不同，这些基于核酸的药物旨在改变基因表达。这种方法已被证明是安全、特异和高效的，导致欧洲药品管理局（EMA）和美国食品药品监督管理局（FDA）批准了几种基因治疗药物，还有更多处于临床试验中。基因治疗对视网膜营养不良具有额外优势，因为眼睛是一个免疫豁免器官，对病毒载体的免疫反应较低。此外，给药的便利性以及眼睛体积小、封闭的特点，使其成为基因治疗的理想靶点。

rAAV介导的基因增补

病毒载体如腺病毒、腺相关病毒（AAV）、慢病毒和单纯疱疹病毒被用作靶向基因治疗的载体，因为它们比非病毒系统具有更高的转导效率和细胞类型特异性。在这些病毒载体中，AAV是FDA和EMA最首选的转基因递送系统，因为它无致病性、能够在不整合入宿主基因组的情况下实现长期转基因表达、广泛的细胞嗜性以及高转导效率。野生型AAV由一个由60个蛋白亚基组成的二十面体衣壳构成，包裹着4.7 kb的单链DNA。基因组两侧是145 bp的反向末端重复序列，作为复制起点并提供包装信号。在重组AAV（rAAV）中，病毒基因被转基因表达盒取代，仅保留反向末端重复序列。这使得rAAV能够将4.7 kb的外源DNA包装并递送到靶细胞中。不同的AAV血清型其衣壳蛋白组成不同，影响其组织嗜性和逃避预先存在抗体的能力。

最早尝试转导小鼠视网膜细胞的研究涉及将编码lacZ报告基因的rAAV进行视网膜下注射。后来，这种方法被用于动物模型，以挽救引起视网膜营养不良的各种基因突变，如PDE6B、PRPH2、MERTK、RHO、CNGB1、SPATA7、RP2、PDE6A和PDE6B。在RP基因敲除小鼠模型中转导rAAV编码的蛋白如CNTF和GDNF，提供了有希望的结果并改善了光感受器存活。类似地，过表达转录因子NR2E3增加了RHO基因表达，减缓了疾病进展，并减少了RHOP23H小鼠模型中的光感受器损失。此外，rAAV基因治疗已被用于转导一个启动子，该启动子能在AIPL突变情况下挽救视杆和视锥细胞变性。

然而，应当承认，尽管有许多试验测试基于基因治疗的方法，但Luxturna是唯一获得FDA批准的用于治疗由RPE65基因突变引起的视网膜营养不良的基因疗法。该基因编码一种将全反式视黄酯转化为11-顺式视黄醇的关键酶。使用腺相关病毒血清型2（AAV2）递送功能性RPE65基因拷贝，从而恢复视觉循环。2015年的一项研究中，通过剪接体介导的RNA反式剪接（SMaRT）技术挽救了RHO mRNA突变，该技术使用前反式剪接分子（PTMs）将突变的外显子替换为正确序列。在体内，rAAV介导的PTMs转导显示出9-22.5%的反式剪接率。在RHO常染色体显性RP（adRP）中，也使用单一rAAV载体包装shRNA以降解突变基因并用正确的cDNA替换，实现了敲低和替代疗法。类似的方法已被用于在RHO敲入小鼠模型中表达mirtrons。随着干细胞模型的进步，iPSC和iPSC来源的RPE和RO已被用于测试rAAV介导的基因增补。PRPF31^+/- iPSC来源的RPE展示了与RP相关的病理缺陷，通过用rAAV-PRPF31转导细胞，这些缺陷得到了部分挽救。RP2敲除的RO和患者来源的突变RP2 RO用RP2-rAAV转导，挽救了外核层变薄并恢复了视紫红质表达。然而，必须牢记与基于病毒的递送治疗相关的风险。尽管rAAV被认为是安全的递送系统，但有报道称病毒基因组在肝脏和心脏中整合。基因组编辑工具的使用，特别是CRISPR诱导的双链断裂，与动物模型中AAV基因组整合增加相关，引发了额外的安全问题。

反义寡核苷酸调控基因表达

反义寡核苷酸（ASOs）是13-30个核苷酸长的合成核酸，正成为调控基因表达的强大工具。ASOs通过标准的Watson-Crick碱基配对与pre-mRNA或mRNA结合，并通过影响pre-mRNA剪接、阻断翻译或促进RNA降解等过程来影响基因表达。它们经过大量化学修饰以抵抗核酸酶介导的降解，并提高其与靶序列结合的 specificity。根据功能，ASOs可分为不同类型。

Gapmer ASOs或siRNAs用于降低基因表达。Gapmers是单链寡脱氧核苷酸（ssODNs），其3'和5'端带有修饰碱基，以保护其免受核酸外切酶降解。当与靶RNA序列结合时，gapmer形成DNA:RNA杂交体，被RNase H识别并切割。而siRNAs是双链RNA分子，利用内源性RNA干扰途径降解转录本。虽然siRNAs在降低基因表达方面比gapmers更有效，但RISC复合物可以容忍少量错配，并可能潜在沉默脱靶基因。此外，siRNA双链中的有义链（乘客链）也可能被加载到RISC复合物中，这进一步增加了影响不相关基因的可能性。

单链ASOs也用于恢复或修饰pre-mRNA剪接。ASOs被设计用于结合调控元件或直接靶向剪接位点，阻止剪接因子和调节剂与靶序列的相互作用。或者，ASOs可以改变剪接位点周围的二级结构，从而改变其被剪接机制识别的可能性。最后，ASOs还可以通过空间位阻阻断翻译抑制因子在非编码5'UTR的结合来增加mRNA翻译。由于其尺寸小且经过修饰，ASOs可以通过视网膜下或玻璃体内注射直接给药，无需载体。

第一代ASOs含有修饰的磷酸骨架，其中非桥接氧被硫取代，使ASOs耐核酸酶。当前使用的ASOs还包括核糖2'羟基基团的修饰，如2'-O-甲基、2'-O-甲氧乙基、2'-氨丙基或2'-氟。必须仔细选择ASO化学结构，因为不同的修饰会影响ASO的稳定性、效力和毒性。尽管它们在治疗几种遗传性疾病方面取得了成功应用，但目前尚无针对RP的ASO药物上市。然而，几种潜在的基于ASO的方法正在研究中。例如，测试了ASO用于阻止USH2A基因内含子突变患者mRNA中插入的隐秘外显子的包含。QR