多技术融合3D生物打印平台Hybprinter-SAM：构建功能梯度骨-腱界面的新突破

《Advanced Composites and Hybrid Materials》：Hybrid Bioprinting for functionally graded tissue engineering constructs with patterned and localized biochemical signals

为破解“软硬材料7个数量级刚度跨度+生化信号空间精准定位”难题，斯坦福团队整合MME/SE/ADE三大打印模块，开发Hybprinter-SAM，实现7阶机械梯度与FGF-2图案化共沉积；hMSC负载构建体培养7天即显著上调SOX9、AGG等纤维软骨标志物，为复杂界面组织再生提供高通量可扩展平台。

　　

论文解读
天然组织从柔软脑组织到坚硬骨组织，刚度跨越7个数量级，且界面内1 mm距离即呈现成分、力学与生物学信号的急剧变化。传统单模块3D生物打印受限于材料-工艺耦合，只能“一机一材”，难以复现这种多尺度梯度。尤其在骨-腱连接部（enthesis），纤维软骨层像“缓冲垫”一样缓解刚度突变，但其发育机制不清，临床重建长期面临高失败率。因此，亟需一种能同时调度软硬材料、又能以微米级精度植入生化信号的“多面手”平台。

为此，斯坦福医学院/工学院联合团队提出“hybprinting”理念，将熔融挤出（MME）、注射挤出（SE）与声学液滴喷射（ADE）整合为一体化Hybprinter-SAM，实现“一层硬骨架-一层软凝胶-一滴生长因子”同步制造。研究以骨-腱再生为场景，验证平台在力学梯度、蛋白图案化和干细胞命运调控三方面的能力。

核心技术方法

1. 多模块协同路径规划：自研C++主控程序解析G-code，分时调度MME/SE/ADE，层厚200 μm，ADE最小液滴2.5 nL。
2. Gelbrin双网络水凝胶：7.5%明胶+1%纤维蛋白原， thrombin/Ca^{/TGase阶梯交联，兼顾打印性与细胞相容性。}
3. 原位交联定位：ADE将FGF-2与凝血酶共打印，局部高密度纤维蛋白网络瞬时形成，锁定蛋白3周缓释。
4. 力学-生物学耦合评测：水下拉伸测试、qPCR定量SOX9/SCL/AGG，以及自制慢拉伸生物反应器模拟体内力学。

研究结果

Hybprinter-SAM系统

• 同一平台兼容PCL、GelMA/alginate、水相生长因子，覆盖10^{–10 kPa刚度区间。}
• 软-硬交织网格经拉伸、扭转、卷曲不开裂；ADE可在384孔板并行输出，理论组合数>10^。

材料与打印工艺优化

• 20 °C打印温度下Gelbrin呈现剪切稀化，丝径500–800 μm；交联后2周保持90%质量，含hMSC样本因细胞-基质互作与ECM分泌，降解速率降低40%，断裂应变提高2倍。

生物相容性验证

• 打印即刻hMSC存活率>95%，距高温PCL丝200 μm内局部降至68%，模拟显示热影响<300 μm；3周代谢活性持续上升，证实全过程细胞友好。

原位交联实现蛋白定位

• 传统“先打印-后泡交联”导致80% BSA在1 h内爆释；改为ADE共打印凝血酶后，3周累计释放<60%，荧光图案边界清晰，未出现侧向扩散。

纤维软骨分化验证

• 骨-腱模拟构建体中，FGF-2图案化组培养7天，SOX9上调约4倍，AGG升高3倍，而COL2未检出，提示早期纤维软骨定向；机械慢拉伸未显著增强标志物，但平台已具备“力学-生化”正交调控能力。

结论与讨论
Hybprinter-SAM首次把ADE无喷嘴、皮升级精准喷射纳入混合生物打印，突破传统“换头-换墨”低效瓶颈，实现7阶刚度连续过渡与多达384种生化信号并行植入。通过原位交锁微区交联，研究解决了“蛋白自由扩散导致信号模糊”的老大难问题，在体外重现了骨-腱界面早期纤维软骨分化的关键转录事件（SOX9^{/SCX）。该平台不仅为复杂界面组织的高通量构建提供工程路径，也为深入解析力学-生化协同调控发育机制奠定技术基础。未来通过扩展生长因子阵列与动态负载，Hybprinter-SAM有望加速肌肉-骨骼界面损伤的精准再生医学转化。}