基于锁相检测的无背景结构光照明显微镜技术实现细胞内细胞器超微结构动态可视化

《Nature Communications》：Visualizing intraorganellar ultrastructures, dynamics, and interactions with open-access background-free Lock-in-SIM

传统结构光照明显微镜(SIM)受离焦模糊和背景干扰影响重建质量，难以解析密集细胞器超微结构。本研究开发了Lock-in-SIM开源框架，通过利用体积样本结构的调制差异实现高效光学切片，显著提升数据保真度和定量能力。该技术成功可视化线粒体分裂和内质网-溶酶体相互作用等动态过程，为细胞器重构机制研究提供了新见解。

　　

在生命科学研究领域，荧光超分辨率显微镜技术革命性地提升了我们对生物结构和动态过程的认识能力。然而，当研究人员试图观察细胞内微小细胞器的精细结构时，传统结构光照明显微术(SIM)却面临着严峻挑战。这些细胞器超微结构的尺寸通常落在SIM的空间分辨率范围内，使得它们极易被即使微弱的背景和运动伪影所掩盖或错误重建。

现有SIM技术存在明显局限性：全内反射SIM(TIRF-SIM)和掠入射SIM(GI-SIM)的成像深度有限，无法覆盖整个细胞；而三维SIM(3D-SIM)通常因需要采集z轴堆栈而面临光漂白增加和时间分辨率降低的问题。尽管近年来出现了多种二维SIM重建算法，如加权线性SIM(WLR-SIM)、Open-SIM、Fair-SIM等，但这些方法在平衡背景抑制和图像保真度方面仍存在不足。

针对这些技术瓶颈，来自牛津大学、华中科技大学和浙江大学的研究团队开发了一种名为Lock-in-SIM的新型重建框架。该方法灵感来源于电子电路中的锁相放大器技术，通过利用周期性SIM照明图案对样本结构的不同调制特性，锁定、提取并放大来自亚衍射尺寸样本特征的弱高频信号，同时最小化非调制背景的影响。

关键技术方法

研究采用定制高速SIM系统进行数据采集，整合二维SIM、TIRF-SIM和三维SIM成像模式。Lock-in-SIM核心算法通过计算三个相位原始图像的直流分量，从原始图像中滤除背景，随后进行超分辨率重建。实验验证使用U2OS细胞系（人骨肉瘤细胞系）进行活细胞成像，通过免疫荧光标记和质粒转染技术标记微管、线粒体、内质网等细胞结构。定量分析采用加权矢量求和算法计算纤维结构取向分布，通过SBR（信背比）指标评估重建质量。

Lock-in-SIM原理验证与背景抑制优势

Lock-in-SIM的核心创新在于重新审视了SIM成像过程，将正弦周期照明图案作为理想的参考信号。研究人员将原始SIM图像强度分布重新表述为调制无关的直流背景分量I_dc(r)和调制相关的交流信号分量I_jac(r)之和，通过计算三个相位偏移照明图案的原始图像，有效分离这两个组分。

实验结果显示，在Sec61β-EGFP标记的内质网成像中，传统二维SIM重建虽然能分辨细微的中空结构，但存在高背景叠加，导致图像对比度和有效分辨率下降。相比之下，Lock-in-SIM在保持TIRF级别对比度的同时，维持了二维SIM的结构完整性，成功突破了背景与深度之间的权衡限制。

优越的图像分辨率与保真度

研究团队将Lock-in-SIM与13种现有算法进行了系统性比较，包括Wiener-SIM、Hessian-SIM、HiFi-SIM等。在模拟、合成和实验珠粒数据集上，Lock-in-SIM重建结果对噪声、视场畸变和背景变化表现出高度鲁棒性。在处理三维体积数据集时，Lock-in-SIM有效消除了离焦背景，仅需标准九幅二维SIM采集图像即可提供高质量伪三维重建。

在不同样本类型的验证中，包括线粒体内外膜、微管、肌动蛋白、溶酶体等结构，Lock-in-SIM均表现出色，有效去除背景的同时保留了聚焦超微结构的高完整性。全局和局部SBR定量分析支持了这一结论，背景抑制后有效分辨率得到显著提升。

高标准全细胞光学切片重建

传统二维超分辨率技术仅改善横向分辨率，缺乏光学切片能力。Lock-in-SIM成功缓解了光学切片、空间分辨率和时间分辨率之间的成像权衡问题。研究人员对单色微管、线粒体、EdU标记复制位点以及双色微管-溶酶体进行了轴向扫描实验，结果表明Lock-in-SIM比标准二维Wiener-SIM重建产生了更高的SBR。

通过颜色编码每个堆栈的像素强度，Lock-in-SIM同时提供了超分辨率和光学切片深度信息。有趣的是，通过取向分析发现，非分裂期微管倾向于均匀朝向细胞迁移方向排列，而分裂期细胞则呈现近乎90°间隔的双峰取向分布，反映了不同生长阶段微管功能的差异。

无偏定量活细胞成像分析

活细胞超分辨率成像是SIM最重要的应用之一，但背景更易干扰活细胞SIM成像结果。研究团队使用Tubulin-488标记的活U2OS细胞记录了长达7分钟的微管动力学过程。与Wiener-SIM相比，Lock-in-SIM有效消除了背景，便于详细动态观察。

通过绘制微管取向分布图（θ角），研究人员能够确定细胞的空间组织。结果显示，基于标准二维SIM结果难以提取密集细胞区域微管取向，而Lock-in-SIM重建能够生成明确的高精度θ映射。时间序列强度和取向图像表明，Lock-in-SIM在不同结构密度水平下均具有重建鲁棒性。

细胞内细胞器超微结构、动态和相互作用可视化

在更具挑战性的生物成像任务中，Lock-in-SIM展现出卓越性能。内质网密集精细的基质结构因空间和时间分辨率不足以及三维投影背景模糊，长期被标准二维SIM误判为扁平片层。通过Lock-in解调，研究人员在存在高背景的二维环境中清晰可视化了内质网基质结构和动态。

得益于Lock-in-SIM的高效时空分辨率，研究团队能够长期追踪溶酶体外部和内部结构的复杂、剧烈和快速形态扭曲。双色时间序列Lock-in-SIM图像显示，溶酶体不仅能够调节内质网小管，还能调节密集的内质网基质。

溶酶体小管（从溶酶体生长出来的管状结构）在溶酶体运输和囊泡分选中起关键作用，其直径相对较细且具有高动态性，传统成像技术难以捕捉。通过清晰成像溶酶体小管，双色时间序列Lock-in-SIM验证了内质网介导的溶酶体小管分裂现象，并进一步揭示小管通过与其与内质网小管的相互作用在不同接触位点从整个溶酶体脱离。

研究结论与意义

Lock-in-SIM框架成功实现了超分辨率活细胞成像中通常对立的目标：高保真、高可量化性、延长时间、高时空分辨率、全细胞和三维光学切片，并具有有效的背景抑制能力。与TIRF-SIM和GI-SIM相比，Lock-in-SIM分别提供约100倍和10倍的成像深度，轻松捕获整个细胞体积。与现有二维SIM重建算法相比，Lock-in-SIM同时具备最佳背景抑制和图像保真度，而与三维SIM相比，Lock-in-SIM成像速度快3倍以上，并允许单z光学切片。

研究在线粒体动态观察方面取得了重要发现。通过长时间动态Lock-in-SIM成像PKmito DEEP RED标记的活体线粒体，研究人员发现了线粒体介导的线粒体分裂(MMF)机制，这一机制不同于经典的线粒体分裂模型。在MMF机制中，线粒体分裂通过线粒体自身之间的相互作用发生。

双色活细胞Lock-in-SIM成像结果显示，在MMF过程中，一个线粒体首先接触另一个线粒体并启动其分裂。此后，位于两个线粒体外膜上的两个Drp1寡聚体同时向接触位点移动，然后合并驱动最终的分裂。这些发现通过揭示MMF机制完善了主流线粒体分裂模型，该机制包括几个动力学上不同的步骤：两个线粒体的接触、Drp1从非分裂线粒体向分裂线粒体的转移（以及分裂线粒体上Drp1沿接触位点定向移动），以及Drp1寡聚体融合产生最终的线粒体分裂。

Lock-in-SIM技术的高质量成像结果通过利用聚焦信号与背景之间的调制差异，并采用锁相解调策略将它们分离。与需要专门硬件或闪烁荧光染料生成周期性参考信号的现有光学锁相检测方法不同，Lock-in-SIM基于任何现有SIM系统的固有调制特性，无需额外的实验要求。此外，Lock-in-SIM通过直接、快速且无参数的AC-DC解调分离聚焦信号与背景，同时不牺牲SIM的九幅图像速度优势。

该研究的方法学有效性和生物学意义在各种挑战性成像场景中得到验证，特别是对于尺寸接近SIM分辨率的密集细胞内细胞器超微结构。得益于卓越的背景去除能力，研究人员能够清晰捕捉内质网基质、溶酶体小管和线粒体内膜的快速形态变化和相互作用。研究发现溶酶体可同时调节内质网小管重塑和基质重塑，观察到内质网介导的溶酶体小管分裂，并阐明了溶酶体小管长度对分裂位置的影响。最重要的是，研究发现线粒体能够调节其他线粒体的分裂，并揭示了所涉及的特定分子机制。这些研究和发现实质性支持和扩展了现有细胞器动态和相互作用模型，增强了我们对基本细胞过程和疾病发病机制的理解。

通过Lock-in-SIM重建将成像质量提升至接近最佳SIM性能，本研究强调了无背景重建易被掩盖的超微结构的重要性，从而启发新的生物学发现。该开源算法框架为商业线性SIM用户提供了全面支持，通过提升成像质量接近最佳SIM性能，为细胞生物学研究提供了强大工具。