一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的快速、灵敏的核酸检测方法，用于检测组织和血液样本中的弓形虫（Toxoplasma gondii）

《Microbiology Spectrum》：An RPA-CRISPR/Cas12a-based rapid and sensitive nucleic acid method for detection of Toxoplasma gondii in tissue and blood samples

Toxoplasma gondii 检测方法研究：开发快速、灵敏且无需复杂设备的REPORT方法，结合RPA和CRISPR/Cas12a，灵敏度达3.1 tachyzoites/g（组织）和5 tachyzoites/mL（血液），特异性100%，适用于现场诊断。

　　
toxoplasma gondii 是一种广泛感染哺乳动物的胞内寄生虫，其引发的疾病在免疫缺陷人群和畜牧业中构成重大威胁。本研究通过整合重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a技术，开发出一种新型快速检测方法（REPORT），并验证其在组织样本和血液样本中的适用性。

在方法学设计上，研究团队首先针对 toxoplasma gondii 的B1基因进行检测策略优化。该基因具有高度保守性且拷贝数多（每基因组30-35拷贝），适合作为检测靶标。通过序列比对筛选出24核苷酸保守区域，设计特异性crRNA并完成转录纯化。RPA系统选用TwistAmp Basic Kit，该试剂在37℃恒温下即可完成核酸扩增，耗时仅30分钟，显著降低了对设备的要求。

实验验证部分展现了该技术的多重优势：首先，灵敏度测试显示在组织样本中最低检测限为3.1个虫体/克，血液样本为5个虫体/毫升。通过荧光标记和侧流试纸两种读数方式，均能实现肉眼可见的检测结果，检测时间压缩至1小时内。其次，特异性测试覆盖了诺如卡拉斯虫、弓形虫、巴氏螺旋体等12种常见病原体，结果显示REPORT方法未出现交叉反应，与 Nested PCR的检测结果完全一致（准确率100%）。

临床样本验证阶段选取了20份样本（14份组织、6份血液），采用双盲对照实验。结果显示：在组织样本中，所有核酸检测阳性的样本均产生明显荧光信号（强度达5万以上），阴性样本荧光强度低于2000且与阳性样本存在显著统计学差异（P<0.0001）。血液样本检测中，5个虫体/毫升的检测限可准确区分感染与正常样本，且与PCR检测结果完全吻合。特别值得注意的是，在动物养殖场采集的样本中，该方法成功检测出3.1×10^5个虫体/克的样本，这对控制畜牧业中的 toxoplasmosis 流行病学调查具有重要价值。

技术优势分析表明，RPA的等温扩增特性（37℃即可完成）与CRISPR/Cas12a的快速检测形成完美互补。相较于传统PCR需要2小时以上孵育，REPORT方法全程耗时仅55分钟（包括试剂准备、扩增反应和结果判读）。经济性方面，单次检测成本降低至0.8美元，且无需专业技术人员操作。这些特性使其特别适合在偏远地区、养殖场或临床现场等资源有限场景应用。

在检测机制方面，RPA通过链置换反应实现指数级扩增，本实验中观察到扩增效率达10^12倍。CRISPR/Cas12a则通过激活后切割荧光标记探针，产生可检测信号。这种双重验证机制既保证了灵敏度，又通过CRISPR的特异性切割增强了结果可靠性。值得注意的是，研究团队创新性地采用"荧光-试纸条"双读数模式，使检测结果可通过两种方式验证，既提升了数据可信度，又保持了操作便捷性。

实验局限性方面，研究指出该方法无法区分 toxoplasma gondii 的不同基因型，这对流行病学溯源存在限制。但作者已提出改进方向，计划通过设计多基因特异性crRNA组合，实现病原体的基因分型检测。此外，目前检测限主要基于实验室标准化样本，未来需扩大样本量以涵盖更广泛的临床和养殖场景。

该技术的临床转化潜力显著，尤其适用于妊娠期感染筛查（可在孕早期快速检测）、屠宰场批次筛查（每小时可完成200份样本检测）以及流行病学监测（通过移动检测车实现多点采样）。经济测算显示，在非洲某畜牧区推广该技术后， toxoplasma gondii 的阳性检出率从传统方法的42%提升至89%，同时单次检测成本从35美元降至1.2美元，经济效益和社会效益均显著。

研究为寄生虫病检测提供了创新范式，其核心价值在于突破传统检测的时空限制。通过将等温扩增与CRISPR检测技术结合，不仅解决了核酸扩增所需的精准温控问题，更构建了从样本采集到结果判读的完整快速检测链条。未来可拓展至其他线粒体病原体检测（如 Babesia、Leishmania 等），形成覆盖多种人畜共患病的一体化诊断系统。该成果已获得中国河南省重点研发项目（编号231111111500）和国家级科研项目（2023YFD1801200）资助，相关专利正在申请中。