CYFIP1通过调控钙离子稳态与线粒体功能介导皮质轴突发育新机制

《Nature Communications》：CYFIP1 governs the development of cortical axons by modulating calcium availability

本研究聚焦神经发育障碍相关蛋白CYFIP1，揭示了其通过稳定电压门控钙通道亚基mRNA调控细胞内钙离子浓度，进而影响线粒体功能与轴突发育的新机制。研究人员发现Cyfip1+/-小鼠胼胝体轴突生长延迟，并通过钙离子载体干预成功挽救轴突生长缺陷，为理解自闭症和精神分裂症的神经连接异常提供了重要理论依据。

　　

在大脑精细的发育过程中，轴突的精准导向和连接形成是神经环路构建的基础。神经发育障碍（NDDs）如自闭症谱系障碍（ASD）和精神分裂症（SCZ）患者常表现出大脑连接异常和胼胝体结构改变，但其背后的分子机制尚不明确。染色体15q11.2区域的拷贝数变异与ASD和SCZ的发病风险密切相关，该区域内的CYFIP1基因被认为是关键致病基因。此前研究表明，Cyfip1杂合（Cyfip1^+/-）小鼠表现出与患者相似的双侧功能连接减弱和胼胝体缺陷，但CYFIP1如何调控轴突发育这一基本问题仍未解决。

发表在《Nature Communications》的这项研究首次阐明CYFIP1通过调控钙离子可用性和线粒体功能在皮质轴突发育中的核心作用。研究人员发现，降低CYFIP1水平会导致细胞内钙离子浓度不足，进而引起线粒体形态和功能异常，最终导致轴突生长延迟。尤为重要的是，通过药物干预提升细胞内钙离子浓度可有效挽救这些缺陷，为相关神经发育障碍的治疗提供了新的思路。

研究团队运用了多种关键技术方法：通过子宫内电穿孔（IUE）技术在体观察轴突发育；利用微流控室系统体外分析轴突生长；采用钙成像技术检测轴突钙离子浓度；通过透射电镜分析线粒体超微结构；结合RNA免疫共沉淀（RIP）和蛋白质免疫共沉淀验证CYFIP1与钙通道mRNA及Hu蛋白的相互作用；使用ATP测定试剂盒评估线粒体功能；并利用急性脑片器官型培养评估在体线粒体膜电位。

+/-小鼠胼胝体投射发育受损'>

轴突发育在体实验证实Cyfip1^+/-小鼠存在缺陷

通过在胚胎期15.5天（E15.5）进行子宫内电穿孔标记胼胝体投射神经元，研究人员发现在出生后5天（P5），Cyfip1^+/-小鼠轴突向对侧皮质的生长显著减少。当共转染野生型CYFIP1 cDNA后，这一缺陷得到挽救，表明轴突生长缺陷是细胞自主性的。至P15时，虽然轴突已抵达目标区域，但生长速度延迟，且终末树枝化程度降低，初级和次级分支数量减少。到P30时，轴突树枝化在基因型间无差异，表明Cyfip1缺失导致的是发育进程延迟而非永久性缺陷。

Cyfip1^+/-皮质轴突线粒体密度和运动性增加

体外微流控实验显示，Cyfip1^+/-皮质神经元的轴突生长速率显著降低。进一步研究发现，突变轴突中的线粒体密度在全轴突及各区域（近端、中部、远端）均增加，而树突中线粒体密度无变化。线粒体总质量检测显示基因型间无差异，提示密度增加可能源于运输异常。kymograph分析发现Cyfip1^+/-轴突中运动线粒体的百分比增加，表明线粒体运输失调。

细胞内Ca²⁺稳态和线粒体功能受损

钙成像显示Cyfip1^+/-神经元在轴突和全细胞层面的钙离子浓度（[Ca²⁺]）均降低。线粒体钙浓度和膜电位（TMRE染色）也下降，ATP水平在发育早期（DIV3）降低。在体实验证实P5小鼠胼胝体轴突的线粒体膜电位降低。电镜分析显示突变轴突中线粒体面积和长轴增加，形态异常。

CYFIP1通过结合Hu蛋白调控特定钙通道亚基表达

RNA免疫共沉淀证实CYFIP1与电压门控钙通道（Cav）亚基Cacna1c、Cacna1e和Cacna1i的mRNA结合。在Cyfip1^+/-神经元中，这些mRNA和蛋白水平（膜组分）在发育早期（DIV3）降低，而非靶标亚基（Cacng2、Cacnb3）无变化。免疫荧光显示Cav2.3和Cav3.3在突变轴突中的蛋白水平显著降低。CYFIP1与HuD（Elavl4）和HuR（Elavl1）蛋白相互作用，且Hu蛋白与钙通道mRNA的结合在突变神经元中减少。放线菌素D实验表明靶标mRNA的稳定性降低。

提升细胞内Ca²⁺浓度可挽救轴突和线粒体表型

离子霉素（lonomycin）处理可提升细胞内钙浓度，使Cyfip1^+/-神经元的轴突生长速率恢复正常，并挽救线粒体运动性增加和膜电位降低的表型。钙通道激动剂Bay-K-8644（L型通道特异性）和Nefiracetam（L/N型通道）处理也能挽救轴突生长延迟，证实钙通道在表型中的直接作用。

研究结论表明，CYFIP1通过与Hu蛋白相互作用稳定钙通道亚基mRNA，确保适当的细胞内钙离子浓度，从而调控线粒体功能和轴突发育。这一机制阐释了CYFIP1缺失导致轴突发育延迟的分子途径，为理解神经发育障碍中的大脑连接异常提供了新视角。研究不仅揭示了CYFIP1在神经发育中的新功能，还提出了通过调节钙稳态治疗相关疾病的潜在策略，对ASD和SCZ的病理机制研究和治疗开发具有重要意义。