利用干涉成像技术实现活体大鼠眼中视紫红质可逆动力学的无创监测

《Nature Communications》：Interferometric imaging of the reversible rhodopsin dynamics in the living rat eye

本研究利用相位敏感光学相干断层扫描技术，首次在活体大鼠视网膜中捕获到视杆细胞外节在光刺激下亚毫秒级的快速收缩现象。通过微秒级光脉冲刺激与逆向异构化实验，揭示了视紫红质激活过程中产生的机电耦合信号，为视觉传导机制研究提供了全新工具，对视网膜疾病诊断具有重要临床价值。

　　

当我们睁开眼睛感受光明时，视网膜上的光感受器正在上演一场精妙的分子舞蹈。视觉始于光感受器中视色素的光异构化，这一过程会引发被称为早期受体电位（ERP）的电信号。然而，传统电生理记录技术存在明显局限：它只能检测到嵌入质膜的少量视紫红质产生的信号，且作为一种侵入性技术，主要适用于离体研究。更为棘手的是，在视锥细胞占主导的灵长类视网膜中，视杆细胞的信号往往被视锥细胞反应所掩盖。

近年来兴起的光视网膜成像（ORG）技术，通过相位敏感光学相干断层扫描（OCT）检测与生理过程相关的视网膜细胞纳米级形变，为视觉研究带来了新的希望。但早期的ORG研究主要集中在视锥细胞，且由于渗透性肿胀和长时程刺激的干扰，与ERP相关的形变信号很大程度上被掩盖。此外，这些研究未能解析视紫红质异构化的亚毫秒级动力学过程。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，斯坦福大学的研究团队通过创新性的实验设计，成功在活体大鼠眼中捕获到了视杆细胞中光异构化的稳健机电信号。研究人员采用高速（10kHz B扫描速率）OCT记录和微秒级光刺激，观察到绿色闪光诱导视杆细胞外节（ROS）在亚毫秒时间内发生数百纳米的快速收缩，而随后的紫外（UV）闪光则能逆转激活的分子，产生幅度相似但方向相反的响应。

关键技术方法包括：搭建高速线扫描光谱域OCT系统进行相位敏感成像；使用长埃文斯大鼠（8雄7雌，11-17周龄）作为实验对象；通过绿色（520nm）和紫外（385nm）激光器提供微秒级光刺激；开发复杂的数据处理算法提取光学路径长度（OPL）变化信号；建立包含横向和轴向粘弹性力的综合模型模拟ROS收缩动力学。

脉冲持续时间对ROS收缩动力学的影响

通过系统改变光脉冲持续时间（50、100、200、500μs和1ms）并保持脉冲能量恒定，研究人员发现短于0.5ms的闪光诱导的最大收缩率潜伏期基本保持一致（约0.45ms），而更长脉冲的响应则明显减慢。

脉冲能量依赖性与饱和趋势

采用100μs闪光并改变能量水平的实验表明，快速收缩幅度随入射光子密度增加而增大，并呈现饱和趋势。在最低脉冲能量下，OPL在闪光后400ms内显著恢复，而在较高能量水平下，收缩保持稳定甚至随时间缓慢增加。

ROS收缩的建模分析

研究人员建立了包含光驱动和热过程的综合模型，考虑了光逆转等关键因素。单纯的准静态模型无法捕捉收缩的潜伏期，而结合横向和轴向粘弹性力的模型则能更好拟合实验数据。最佳拟合得到初始膜张力τ₀为0.59μN m^-1，弯曲模量κ_c=0.23×10^-19 N m。

UV闪光诱导的逆向异构化

在绿色闪光充分漂白视紫红质后，施加UV闪光可引发ROS伸长（时间常数约10ms），表明发生了与典型ERP极性相反的逆向响应。随后的绿色闪光诱导的收缩比对照组更强，说明部分光色素恢复了对绿色光子的响应能力。

研究结论表明，ROS中测量的ΔOPL主要源于机械形变而非折射率变化。光异构化引起的折射率变化在OCT中心波长（840nm）仅为10^-5量级，对应的ΔOPL小于1nm。热效应在最高漂白水平下导致温度升高小于0.5°C，相关的外节热膨胀小于10nm，与观察到的数百纳米ROS收缩相比可忽略不计。

与视锥细胞外节（COS）不同，ROS中的膨胀相更弱且更慢，因此不会掩盖收缩信号。这可能是由于ROS的结构特点：除了少数新生盘膜外，ROS主要由密集堆积的封闭盘膜组成，包裹在紧密的质膜内，膨胀空间有限。而在COS中，盘膜是共同质膜的内褶，为膨胀提供了充足空间。

该研究的重大意义在于首次在活体条件下实现了对视杆细胞中视紫红质动力学的无创监测。ORG技术通过整合所有盘膜的响应，超越了电学方法的灵敏度，为视觉转导的基础研究和更特异的临床诊断打开了新的大门。特别是其微秒级时间分辨率为在体研究视觉转导提供了全新工具，结合自适应光学（AO）技术后，甚至有望实现单细胞空间分辨率的功能成像。