可编程靶向RNA降解技术dCasCMA：通过dCas13d引导的分子伴侣介导的自噬实现高效特异性RNA清除

《Nature Communications》：Programmable targeted RNA degradation via dCas13d-directed chaperone-mediated autophagy (dCasCMA)

本文介绍了一种名为dCasCMA的新型RNA靶向降解平台，该技术将dCas13d的精准靶向能力与分子伴侣介导的自噬(CMA)降解机制相结合，成功实现了外源性和内源性RNA的高效降解。研究人员通过系统优化连接子长度和CMA靶向基序，证实该平台能在活细胞和动物模型中同时降解多个RNA靶点，为病毒性疾病和肿瘤治疗提供了创新策略。

　　

在生命科学领域，RNA靶向降解技术一直是研究热点。随着人类基因组计划的完成，科学家发现超过70%的人类基因组能够转录为RNA，但仅有约1.5%编码蛋白质。这一发现极大地拓展了RNA作为治疗靶点的潜力。然而，现有的RNA干扰(RNAi)技术存在脱靶效应和非特异性免疫反应等问题，而CRISPR-Cas13系统虽然具有更高的特异性，但其"旁观者RNA切割"现象可能引起细胞毒性，限制了其临床应用。

面对这些挑战，南开大学刘树林团队在《Nature Communications》上发表了创新性研究成果。他们开发了一种名为dCasCMA的新型平台，将催化失活的dCas13d与分子伴侣介导的自噬(CMA)靶向基序相结合，建立了可编程的靶向RNA降解系统。该系统通过dCas13d的精准靶向和CMA途径的高效降解能力，实现了特异性RNA的溶酶体降解。

研究团队采用的主要技术方法包括：蛋白质工程构建dCas13d-CMA靶向基序(dCCTM)融合蛋白；指导RNA(gRNA)设计优化；多重效应指导阵列(MEGA)技术实现多靶点同时降解；纳米脂质体(NLP)包裹技术用于体内递送；以及使用日本脑炎病毒(JEV)感染的小鼠模型评估治疗效果。

开发dCasCMA平台用于RNA靶向降解

研究人员首先将dRfxCas13d与CMA经典靶向基序KFERQ(CTM1)通过柔性连接子融合，构建了dCCTM1融合蛋白。该系统在JEV感染的BHK细胞模型中表现出良好的RNA降解效果。通过系统优化连接子长度，发现含有三个GGGGS重复的连接子效果最佳。进一步将CMA靶向基序优化为KFERQKILDQRFFE(CTM2)后，降解效率提高了1.2倍。

dCasCMA系统的RNA降解机制

通过免疫荧光和Western blot分析，研究人员证实dCasCMA能有效降低JEV E蛋白表达，且呈剂量依赖性。共聚焦显微镜观察显示mNeonGreen标记的dCCTM/gJEV-C复合物与溶酶体标志物显著共定位。HCR-FISH实验证明病毒RNA被成功转运至溶酶体。通过siRNA敲低CMA通路关键蛋白LAMP2A和HSC70，以及使用CMA调节剂QX77和VER-15508，进一步验证了dCasCMA依赖CMA途径实现RNA降解的特异性。

使用dCasCMA系统降解内源性mRNA

研究团队将dCasCMA应用于肿瘤免疫治疗重要靶点PD-L1 mRNA的降解。在CT26肿瘤细胞中，dCCTM/gPdl1-D组合能降解约80%的Pd-l1 mRNA，效果与siRNA相当。转录组分析显示，PD-L1敲低后，PI3K、β-catenin、WIP、N-cadherin和Vimentin等上皮-间质转化(EMT)相关基因表达下调，细胞迁移能力显著降低。此外，研究人员还开发了dCasCMA-NCS变体，通过引入核定位信号(NLS)和核输出信号(NES)，成功提高了对核内长链非编码RNA NEAT1的降解效率。

dCasCMA系统的多重RNA降解能力

针对病毒感染过程中多个致病因子同时表达的特点，研究团队设计了靶向JEV RNA、ZBP1 mRNA和STING mRNA的多重gRNA表达阵列(gJZS)。实验结果显示，dCCTM/gJZS能同时降解三种靶RNA，显著降低促炎细胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6等)表达，同时上调抗炎因子IL-10。细胞活力实验证实该处理能有效缓解病毒感染引起的细胞病变效应。

dCasCMA系统的体内RNA降解效果

研究人员将dCCTM蛋白和gJZS封装于纳米脂质体中，通过脑室注射给药治疗JEV感染的小鼠模型。结果显示，NLP@dCCTM/gJZS处理能显著降低脑组织中病毒RNA和Zbp1、Sting mRNA水平，减轻炎症细胞浸润和组织损伤。细胞因子检测证实促炎因子表达下降，抗炎因子IL-10表达上升，表明dCasCMA在体内具有显著抗病毒和抗炎效果。

该研究开发的dCasCMA技术成功解决了现有RNA降解技术的多个局限性。与传统RNAi相比，dCasCMA具有更高的特异性；与野生型Cas13相比，避免了旁观者切割效应。系统通过CMA途径实现RNA降解，不依赖翻译抑制，能更彻底地清除靶RNA。平台的多重靶向能力使其能同时应对病原体清除和免疫调节双重挑战，在病毒性疾病和肿瘤治疗中展现广阔应用前景。自限性的药代动力学特征进一步增强了其治疗安全性。这项研究不仅为RNA靶向治疗提供了新工具，也拓展了人们对溶酶体在核酸降解中作用的认识。