PCM1通过协调中心体不对称性与极化内体动力学调控子代细胞命运

《Nature Communications》：PCM1 coordinates centrosome asymmetry with polarized endosome dynamics to regulate daughter cell fate

本研究聚焦于脊椎动物放射状胶质前体细胞（RGP）不对称分裂（ACD）的调控机制。为解决中心体不对称性如何影响细胞命运这一关键问题，研究人员围绕中心体蛋白PCM1展开研究。结果揭示，PCM1通过促进Par-3和动力蛋白（dynein）在回收内体（recycling endosome）上形成大分子复合物，协调Notch配体DeltaD（Dld）内体的极化运输，从而维持RGP的干性。该机制在人类皮质类脑器官中保守存在，为神经发育疾病提供了新见解。

　　

在大脑发育的宏伟蓝图中，放射状胶质前体细胞（RGP）扮演着神经干细胞的角色，它们通过精巧的不对称细胞分裂（ACD）来平衡自我更新与分化，源源不断地产生神经元，构建出复杂的神经系统。在这个过程中，两个关键细胞器的不对称性至关重要：中心体和内体。中心体作为细胞的微管组织中心，在细胞分裂时会进行半保守复制，产生在年龄和蛋白组成上均不同的母中心体和子中心体。研究表明，神经前体细胞会不对称地继承中心体，并且这种不对称性与子代细胞的命运决定相关。然而，中心体的这种不对称性究竟是如何转化为细胞命运差异的，其内在机制一直笼罩在迷雾之中。

与此同时，Notch信号通路的不对称分布是决定子代细胞命运的另一个关键因素。在诸如斑马鱼胚胎RGP等细胞中，含有Notch配体DeltaD（Dld）的内体在细胞分裂后期会极化地富集到未来保持干性的子细胞一侧。这种极化运输依赖于极性蛋白Par-3（在人类中称为PARD3）和动力蛋白（dynein）马达复合物。但一个核心的悬而未决的问题是：中心体的不对称性与内体的极化动力学之间是否存在联系？又是何种分子在其中扮演“联络官”的角色？

近期发表在《Nature Communications》上的一项研究，由Xiang Zhao、Su Guo等科学家共同完成，为我们揭开了这一谜题的关键一角。他们的研究发现，中心体周围材料蛋白1（PCM1）正是连接中心体不对称性与内体极化动力学的关键分子桥梁，从而精确调控RGP的子代细胞命运。

为了深入探究这一机制，研究人员综合运用了多种先进的技术方法。研究主体利用斑马鱼胚胎作为在体模型，通过体内实时成像技术直观观察了RGP分裂过程中Pcm1与Dld内体的动态行为。通过CRISPR-Cas9技术构建了pcm1基因敲除（KO）斑马鱼模型，并利用吗啉代寡核苷酸（MO）进行基因敲低，以验证Pcm1的功能。超高分辨率显微镜技术——标记保留膨胀显微镜（LR-ExM）被用于以纳米级分辨率解析Pcm1、Par-3、动力蛋白复合体组分（如Dlic1、P150）以及内体标记物（Rab5b, Rab11a）在Dld内体上的共定位情况。此外，研究还采用了克隆谱系追踪、RNA测序（RNA-seq）分析转录组变化、体内免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白相互作用，并在人类诱导多能干细胞（hiPSC）来源的2D神经玫瑰花结和3D大脑类器官模型中验证了核心发现的保守性。

Pcm1在斑马鱼前脑有丝分裂RGP中定位于中心体和内体

研究人员首先利用定制抗体，在斑马鱼胚胎前脑有丝分裂的RGP中描绘了Pcm1的精细分布图谱。他们发现，在分裂中期和后期，Pcm1以云状模式分布在γ-微管蛋白（γ-tubulin）阳性的中心体周围，并且经常沿着胚胎的前后（A-P）轴表现出不对称性，更多的Pcm1富集在后部的中心体周围。通过标记母中心体的标志物CEP83，他们确认Pcm1总是与CEP83共同定位在后部的母中心体上。

出乎意料的是，Pcm1的免疫反应性也频繁出现在分离的细胞核之间的区域，即中央区。这个区域是中心纺锤体所在之处，是细胞器运输和分选活跃的地方。通过表达Pcm1-linker-GFP并进行体内实时成像，研究人员观察到Pcm1-GFP斑点与内源性内化的Dld内体邻近，并且它们共同向后极移动。到分裂末期，大多数Pcm1-GFP和Dld内体都富集在后代子细胞中。这些结果揭示了Pcm1在有丝分裂过程中一种此前未知的不对称分布：既不对称地分布于两个中心体之一（后部母中心体），也在分裂后期位于中央区靠近Dld内体的位置，并在ACD后优先定位于后部子细胞。

Pcm1是Dld内体后向运动所必需的

为了探究Pcm1的功能，研究人员在pcm1缺陷（MO和KO）胚胎中观察了内化Dld内体的动力学。在野生型RGP中，内化的Dld首先汇聚到中央区，然后极化地向后部运动。然而，在pcm1缺陷的RGP中，Dld内体不对称地分离到后部子细胞的能力显著降低。共注射pcm1 mRNA可以恢复这种不对称分布。对单个内体动力学的分析表明，pcm1缺陷的内体运动轨迹杂乱，缺乏明确的后向方向性，但其平均运动速度反而高于对照组，表明Pcm1的缺失导致的是方向性缺陷而非运动性不足。这些结果明确表明，Pcm1对于促进Dld内体的后向极化动力学是必需的。

pcm1在克隆水平上调控祖细胞分裂模式和子代细胞命运的需求

为了确定Pcm1对RGP分裂模式和子代细胞命运的影响，研究人员进行了克隆分析。通过长期活体成像追踪单个RGP的分裂命运，他们发现，在对照组中，RGP分裂表现为祖细胞/祖细胞（P/P）、祖细胞/神经元（P/N）和神经元/神经元（N/N）三种模式。而在pcm1 MO胚胎中，P/P和P/N分裂减少，N/N分裂则显著增加至49%。EdU脉冲追踪实验也证实，pcm1缺陷胚胎中神经元产量增加，而以祖细胞库的耗竭为代价。这些发现在克隆水平上揭示了Pcm1通过维持P/P和P/N分裂、抑制N/N分裂来维持RGP祖细胞命运的关键作用，这很可能源于其调控Dld内体不对称分布的功能缺陷导致的Notch信号异常。

高分辨率膨胀显微镜揭示Pcm1与Par-3、Rab5b和Rab11a在Dld内体上的共定位

为了理解Pcm1如何促进Dld内体的后向运动，研究人员利用标记保留膨胀显微镜（LR-ExM）以超高分辨率解析了蛋白质的共定位情况。他们发现，在分裂后期的RGP中央区，Pcm1与Par-3在Dld内体上交织分布。大多数中央区的Dld内体同时含有Pcm1和Par-3。利用早期内体标记物Rab5b和回收内体标记物Rab11a，研究人员进一步发现，Pcm1与两者在Dld内体上均有关联。定量分析表明，含有Pcm1和Rab11a的Dld回收内体在中央区相对富集，而含有Pcm1和Rab5b的Dld早期内体则在中央区相对匮乏。这些结果揭示了中央区相对富集的是Pcm1阳性的Dld回收内体。

Pcm1是中央区Dld内体上Par-3-动力蛋白大分子复合物形成所必需的

那么Pcm1在Dld内体上具体扮演什么角色？通过高分辨率膨胀显微镜分析pcm1缺陷的胚胎，研究人员发现，在对照组中，大多数Dld内体同时被Par-3和动力蛋白复合体组分Dlic1所标记。然而，在pcm1缺陷的胚胎中，Par-3⁺Dlic1⁺的Dld内体显著减少，而只有Par-3或只有Dlic1标记的内体相应增加。此外，Par-3⁺或Dlic1⁺的Dld内体上Dld的信号强度和面积也显著小于Par-3⁺Dlic1⁺的内体。这些发现表明，Pcm1是促使Par-3和动力蛋白复合体在Dld内体上共同聚集、形成功能性大分子复合物所必需的，并且对于这些内体的完整性也至关重要。

Pcm1是早期内体向回收内体运输所必需的

鉴于Pcm1与普通内体蛋白（包括Rab11a和Rab5b）的关联，研究人员推测其功能可能不限于Dld内体。他们分析了有丝分裂RGP中标记Rab11a或Rab5b的内体。在对照组中，中央区大多数回收内体同时含有Par-3、Rab11a和动力蛋白复合体的亚基P150。而在pcm1缺陷胚胎中，这种三阳性内体显著减少。相反，中央区含有Par-3、Rab5b和P150的早期内体数量则显著增加。这些数据表明，Pcm1是Rab5⁺早期内体向Rab11⁺回收内体运输过程所必需的，这一缺陷可能导致pcm1缺陷的有丝分裂RGP中央区功能性回收内体减少。

人皮质类脑器官有丝分裂神经祖细胞中PCM1的不对称性及与PARD3、RAB11A的共定位

为了验证PCM1与内体的关联是否在物种间保守，研究人员在hiPSC来源的神经祖细胞（包括2D神经玫瑰花结和3D类脑器官）中进行了研究。发现在分裂后期/末期的神经祖细胞中，PCM1、PARD3和回收内体蛋白RAB11A大多呈不对称分布，而早期内体标记RAB5B则多为对称分布。定量分析显示，PCM1与PARD3、RAB11A存在显著的共定位，而与RAB5B的共定位较少。这表明PCM1与PARD3、回收内体蛋白RAB11A的关联及其在有丝分裂神经祖细胞中的不对称分布从鱼类到人类是保守的。

人皮质类脑器官有丝分裂神经祖细胞中PCM1在母中心体上的不对称性及与CEP83的共定位

进一步研究发现，在人神经祖细胞中，PCM1在中心体上也表现出不对称性。在中心体PCM1不对称的细胞中，富含PCM1的中心体总是CEP83阳性的，表明PCM1定位在母中心体上。有趣的是，仔细检查发现PCM1和CEP83集中在母中心体不同的中心粒上，提示了其在中心体上的精确定位。

综上所述，这项研究成功地揭示了PCM1在协调中心体不对称性与内体极化运输中的核心作用。它通过以下机制调控RGP的命运决定：在分裂中期，PCM1不对称地富集于后部母中心体（标记为CEP83）；到分裂后期，Pcm1被部署到中央纺锤体，与Dld内体结合，并通过促进内体从Rab5⁺早期阶段向Rab11⁺回收阶段过渡，以及促进Par-3和动力蛋白大分子复合物在回收内体上的组装，来指导内体向后极的运输，从而将高水平的Notch信号传递到继承母中心体的子细胞中，维持其祖细胞特性。这项研究不仅阐明了中心体不对称性影响细胞命运的一条具体分子通路，将两个关键的细胞事件——中心体继承和内体运输——联系起来，而且其在人类类脑器官中的保守性也提示了PCM1相关机制在人类大脑发育和相关疾病（如神经精神疾病）中可能具有的重要作用，为未来的相关研究提供了新的视角和靶点。