CTLH泛素连接酶通过降解ZMYND19-MKLN1复合物在溶酶体膜负调控mTORC1的新机制

《Nature Communications》：The CTLH ubiquitin ligase substrates ZMYND19 and MKLN1 negatively regulate mTORC1 at the lysosomal membrane

本研究针对PI3K/mTOR信号异常激活的EBV相关胃癌（EBVaGC），通过全基因组CRISPR/Cas9筛选发现CTLH E3连接酶多个亚基与PI3K抑制剂alpelisib具有合成致死效应。研究人员揭示CTLH通过蛋白酶体途径降解其底物ZMYND19和MKLN1，而这两种蛋白的积累会在溶酶体膜上形成复合物，通过阻断mTORC1与Rheb及其底物S6K/4E-BP1的相互作用来抑制mTORC1活性。该研究不仅阐明了CTLH-ZMYND19-MKLN1轴调控mTORC1的新机制，更为PI3K高活性肿瘤的联合治疗提供了新靶点。

　　

在胃癌的各种亚型中，Epstein-Barr病毒相关胃癌（EBVaGC）因其独特的分子特征而引人注目。这种癌症最显著的特点是高频率的PI3K信号通路激活——超过80%的病例存在PI3K催化亚基PIK3CA的突变，远高于其他胃癌亚型的3-42%突变频率。PI3K-AKT-mTOR通路作为细胞增殖、生存和代谢的核心调控者，其异常激活成为癌症治疗的重要靶点。然而，PI3K抑制剂的临床应用受到耐药性和剂量相关毒性的限制，促使科学家寻找能够与PI3K抑制剂产生协同作用的联合治疗策略。

为了解决这一挑战，由Yin Wang、Yifei Liao等研究人员组成的团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新发现。他们选择YCCEL1这一EBVaGC细胞系作为研究对象，该细胞系不仅表达EBV编码的EBNA1和LMP2A蛋白，还携带PIK3CA组氨酸1047精氨酸功能获得性突变。研究人员首先证实了PI3K抑制剂alpelisib能够以剂量依赖方式抑制AKT磷酸化，并在0.5μM浓度下使YCCEL1细胞增殖降低约50%。

为了系统性寻找与alpelisib具有合成致死效应的靶点，研究团队进行了全基因组CRISPR/Cas9筛选。这一创新性方法揭示了多个C末端至LisH结构域（CTLH）E3连接酶亚基是顶级筛选命中点，包括催化亚基MAEA。CTLH复合物在酵母中已知负调控糖异生，但在高等生物中的功能，特别是在胃癌背景下的作用尚未被探索。

研究人员通过多组学分析发现，CTLH通过控制mTORC1活性来支持EBVaGC细胞存活，这一过程依赖于其对底物ZMYND19和MKLN1水平的调控。当CTLH活性受到干扰时，ZMYND19和MKLN1在细胞内积累，两者相互结合并定位于溶酶体外膜，进而抑制mTORC1活性。值得注意的是，ZMYND19和MKLN1并不干扰mTORC1向溶酶体的招募，而是阻断mTORC1与Rheb的相互作用，以及mTORC1与其底物S6和4E-BP1的结合。

为了开展这项研究，团队应用了几项关键技术方法：首先利用全基因组CRISPR/Cas9筛选技术鉴定与PI3K抑制剂alpelisib合成致死的靶点；采用转录组测序（RNAseq）和蛋白质组学分析CTLH缺失的分子效应；通过靶向液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行代谢物分析；使用Seahorse能量代谢分析仪评估细胞代谢状态；利用溶酶体免疫纯化技术（LysolP）研究蛋白质定位；并通过免疫共沉淀和体外转录技术验证蛋白质相互作用。研究使用的细胞模型包括EBV阳性胃癌细胞系YCCEL1和SNU-719，以及EBV阴性胃癌细胞系作为对照。

CTLH抑制引起代谢重编程

CTLH是一个异常复杂的泛素E3连接酶，由至少九个组分构成。研究人员发现MAEA敲除（KO）与alpelisib联合处理比单独处理更能减少YCCEL1活细胞数量。细胞周期分析表明，MAEA KO或alpelisib单独处理减少了S期细胞数量，而两者联合则导致广泛的细胞死亡。代谢组学分析显示，MAEA编辑最显著地扰乱了糖酵解、戊糖磷酸、核黄素、嘧啶和嘌呤代谢通路。在alpelisib处理的MAEA KO细胞中，糖酵解和丙酮酸代谢是受影响最显著的代谢通路。

ZMYND19和MKLN1形成负调控mTOR的复合物

RNAseq分析发现，mTORC1和异生素代谢通路是MAEA KO最显著改变的信号通路。MAEA KO降低了mTOR靶标S6K激酶和4E-BP1的磷酸化水平，且MAEA缺失和alpelisib对S6K T389和4E-BP1 S65磷酸化的抑制具有叠加效应。全细胞蛋白质组学分析表明，MKLN1和ZMYND19的丰度在CTLH扰动后显著增加。蛋白酶体抑制剂硼替佐米处理增加了稳态MKLN1和ZMYND19水平，支持它们受蛋白酶体降解的调控。

ZMYND19和MKLN1结合并阻断mTORC1与Rheb和TOS基序的结合

研究人员进一步探索了ZMYND19和MKLN1在阻断mTORC1活化中的机制。他们发现MAEA KO并不改变mTOR在氨基酸刺激后的溶酶体亚细胞定位，表明ZMYND19/MKLN1并不阻断mTORC1向溶酶体的招募。重要的是，MAEA KO削弱了Raptor与Rheb的结合，也损害了Raptor与mTORC1底物S6K和4E-BP1的结合。ZMYND19和MKLN1过表达足以阻断Raptor与Rheb的结合，并削弱Raptor与S6K和4E-BP1的结合。

研究结论表明，CTLH E3连接酶通过调控其底物ZMYND19和MKLN1的稳定性，在溶酶体膜上精细调节mTORC1活性。当CTLH功能正常时，它促进ZMYND19和MKLN1的降解，允许mTORC1充分活化。而当CTLH活性受到抑制时，ZMYND19和MKLN1在溶酶体膜上积累，形成复合物，通过空间位阻或变构干扰机制阻断mTORC1与激活因子Rheb及其底物的相互作用，从而抑制mTORC1信号通路。

这项研究的重要意义在于揭示了CTLH-ZMYND19-MKLN1轴作为mTORC1新型调控机制，为理解细胞如何通过泛素-蛋白酶体途径快速调节mTORC1活性提供了新视角。特别是在PI3K信号高度活跃的肿瘤背景下，这一通路可能成为联合治疗的理想靶点。由于CTLH在多种人类细胞类型和组织中均有表达，且CTLH亚基在多种人类肿瘤中过表达，这一发现可能具有广泛的癌症治疗意义。此外，研究还提出了开发CTLH抑制剂的治疗潜力，尤其是与低剂量FDA已批准的PI3K抑制剂如alpelisib联合使用，可能为EBVaGC及其他依赖过度活跃PI3K/mTOR信号的肿瘤提供新的治疗策略。