《Process Biochemistry》：Design and optimization of a cyanide dihydratase-cross-linked enzyme aggregate system for enhanced biodegradation of cyanide: Integrating statistical and machine learning approaches
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本研究开发基于CLEAs的氰化物降解系统，通过响应面法和人工神经网络优化条件，验证了其高稳定性和90.5%去除效率，为工业生物修复提供新策略。
阿德马金瓦·A·纳尔逊（Ademakinwa A. Nelson）|阿古恩比亚德·M·奥拉德莱（Agunbiade M. Oladele）|阿德耶安朱·M·莫龙克（Adeyanju M. Moronke）|阿里·卡齐姆（Alli Kazeem）|艾因拉·Z·阿德尼克（Ayinla Z. Adenike）
尼日利亚埃利扎德大学（Elizade University）物理与化学科学系（Department of Physical & Chemical Sciences）生物化学专业（Biochemistry Program）
摘要
本研究开发了一种高效的氰化物生物降解系统，该系统利用了来自Aureobasidium pullulans NAC8菌株的氰化物二氢酶（ApCynD）交联酶聚集体（CLEAs）。这种细胞内酶被固定为cynD-CLEA形式，并与游离酶进行了对比测试。固定化显著提高了酶的稳定性：经过七次重复使用后，其活性仍保持超过90％；储存六周后活性仍保持在80％以上。结构分析显示，α-螺旋结构（29.4–38.8％）和β-折叠结构（12.6％至18.4％）的含量增加，而β-折叠片层和无规卷曲结构的含量减少，表明酶的构象更加有序。动力学研究表明，尽管Km值有所增加，但Vmax值和催化效率却得到了提升。通过响应面方法（RSM，R2 = 0.902）和人工神经网络（ANN，R2 = 0.958）优化了工艺条件。实验结果表明，氰化物浓度是影响降解效果的最关键因素，最佳条件为1000 ppm、150 rpm、1000 mg CLEA、3小时，此时氰化物的去除率可达82％；人工神经网络预测的最佳条件（240 ppm、200 rpm、865 mg CLEA、6小时）下，去除率达到了90.5％，这进一步证明了该模型在处理非线性关系时的有效性。SHAP分析增强了模型的可解释性。这种RSM-ANN集成方法为基于酶的生物修复技术提供了强有力的优化策略，cynD-CLEA在工业应用中展现出巨大潜力。建议进一步研究以评估更广泛的工艺条件和更长的操作周期。
引言
氰化物是一种高毒性污染物，常作为金矿开采、电镀和合成化合物制造等工业过程的副产品释放到环境中。其毒性主要源于其对细胞色素c氧化酶的强烈亲和力，而这种酶是线粒体电子传递链中的关键组成部分。氰化物通过抑制该酶来破坏包括微生物在内的多种生物的细胞呼吸。氰化物在水生或陆地生态系统中的积累对环境和公共健康构成了严重威胁[1]、[2]。
鉴于这些风险，生物修复作为一种可持续且环保的氰化物解毒方法应运而生[3]。该方法利用微生物或酶系统将氰化物转化为危害较小的物质[4]、[5]、[6]。像氰化物二氢酶这样的酶特别具有吸引力，因为它们能够在无需辅因子的情况下催化氰化物的降解，从而简化了工业应用中的工艺集成[7]。罗丹酶（Rhodanese）也能参与氰化物的解毒过程，但需要硫供体才能将其转化为硫氰酸盐[8]、[9]。
氰化物二氢酶（CynD）在温和的操作条件下能够将氰化物高效水解为氨和甲酸这两种无毒产物[10]。这些产物可以被环境中的微生物迅速吸收或进一步代谢：氨通过谷氨酰胺合成酶–谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）途径进入氮循环，而甲酸则可以通过甲酸脱氢酶氧化为二氧化碳，或被整合到涉及四氢叶酸衍生物的一碳代谢途径中[11]。这些代谢途径提升了使用CynD进行氰化物生物修复的生态可行性。
由于其多功能性，氰化物二氢酶在处理含氰化物的废水（尤其是来自金矿和电镀行业的废水）方面具有巨大潜力。然而，为了实现大规模应用，必须对这种酶进行稳定处理，以便重复使用和长期储存。传统的酶固定化方法（如吸附、包埋和共价结合）常常受到使用过程中酶损失、底物扩散受限以及运行成本较高的限制[12]。因此，需要开发新的固定化策略。
交联酶聚集体（CLEAs）是一种无需载体支持的酶固定化方法，能够同时提高酶的稳定性和催化性能。该过程首先通过硫酸铵或选定的有机溶剂等试剂诱导酶聚集，随后使用戊二醛等双功能试剂对酶聚集体进行化学交联。由此获得的生物催化剂不溶于水，通常具有更好的耐热性、耐有机溶剂性，并且使用寿命更长[13]、[14]。与载体结合的固定化方法相比，CLEAs允许更高的酶负载量，并减少了扩散限制，使其非常适合用于生物修复和其他工业应用中的重复或连续操作。
在本研究中，我们利用从Aureobasidium pullulans NAC8菌株中分离出的氰化物二氢酶开发了一种基于CLEA的系统（称为< />cynD-CLEA系统在处理金矿和电镀等行业产生的含氰化物废水方面表现出高效性能，这些行业中的氰化物污染问题十分突出。
材料与方法
用于氰化物降解的Aureobasidium pullulans菌株NAC8最初是根据其形态和分子特征从土壤中分离出来的，随后被用于酶的生产。其核苷酸序列已存储在NCBI GenBank中（登录号KX023301 [15]）。该菌株是本研究中使用的氰化物二氢酶（ApCynD）的生物来源。该菌株在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上培养，并维持在4°C条件下。
A. pullulans NAC8氰化物二氢酶的生产
图1展示了A. pullulans NAC8菌株通过浸没发酵生产氰化物二氢酶的过程，12天后达到最高产量。由于未检测到细胞外活性，因此氰化物二氢酶是在细胞内产生的。最高产量出现在培养第8天，此时的比活性为4.1单位/毫克。这是首次报道通过真菌直接将氰化物转化为甲酸的案例。
结论
本研究证明了利用交联酶聚集体（CLEAs）从Aureobasidium pullulans NAC8菌株中有效生产并固定氰化物二氢酶的方法。固定化的酶表现出更好的操作稳定性：经过七次重复使用后活性仍保持超过90％；储存六周后活性仍保持在80％以上。固定化使酶的最适温度从40°C升高至50°C，并提高了热稳定性（表现为半衰期延长）。
作者贡献声明
阿德马金瓦·阿德德吉·纳尔逊（Ademakinwa Adedeji Nelson）：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、项目监督、资源协调、方法设计、实验设计、资金筹集、数据分析、概念构思。阿古恩比亚德·马约瓦（Agunbiade Mayowa）：项目协调、资金筹集、数据分析、数据管理、概念构思。阿德耶安朱·穆伊纳特（Adeyanju Muinat）：撰写——审稿与编辑、结果验证、资源协调、项目监督、数据分析、概念构思。阿里·卡齐姆（Alli Kazeem）：
作者的咨询关系
作者与本手稿内容无关的任何咨询关系。
作者的任职情况
所有作者均不属于可能从本研究结果中获益的任何组织。
专利情况
本研究未获得任何公共部门、商业机构或非营利组织的资助。利益冲突声明
我们声明，作为作者，不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。
