通过转化未成熟的单倍体胚胎实现转基因和编辑小麦的快速遗传稳定

《Plant Biotechnology Journal》：Rapid Genetic Stabilisation of Transgenic and Edited Wheat Through Transformation of Immature Haploid Embryos

双单倍体小麦转基因与基因编辑高效体系的建立及遗传稳定性分析

　　
本研究通过整合小麦单倍体诱导技术与基因编辑手段，建立了高效的小麦转基因和基因编辑体系。研究团队利用自主研发的小麦单倍体诱导系HIPE（Haploid Inducer with Purple Embryo），以Fielder品种为母本进行杂交，成功筛选出白化未成熟胚胎作为转化靶标。通过Agrobacterium介导的转化技术，将GUS报告基因、RUBY色素标记基因及靶向TaWaxy基因的CRISPR/Cas9系统整合到胚胎组织，最终获得139株高效转基因植株，其中基因编辑转化效率达78.4%。该技术突破传统需要多代自交的纯合化瓶颈，通过染色体加倍处理直接获得T0代纯合植株，将小麦遗传改良周期缩短60%以上。

研究创新性地将颜色标记技术与基因编辑结合。HIPE系通过引入胚胎特异性紫色标记基因（ZmC1/ZmR），使得杂交产生的单倍体胚胎呈现白色，而二倍体胚胎则保持紫色特征，这一视觉差异为单倍体筛选提供了直观标准。转化效率较传统方法提升3倍，其中GUS报告基因转化效率达72.2%，RUBY色素标记基因转化效率66.7%，靶向Waxy基因的CRISPR编辑效率78.4%。通过优化染色体加倍方案（5mmol/L colchicine或0.12mmol/L propyzamide处理），最终获得纯合T0代植株的效率达43.8%-54.3%。

在基因编辑方面，研究团队重点靶向小麦关键品质基因TaWaxy（编码直链淀粉合成酶）。通过设计靶向第四外显子的sgRNA，成功实现双等位基因的精准编辑。分子检测显示92.7%的编辑事件发生在预期位点，且所有编辑植株在T1代均保持遗传稳定性。特别值得注意的是，编辑后的植株在碘-碘化钾染色（I2-KI）下呈现出明显的淀粉特性改变，编辑植株的籽粒淀粉结构较野生型显著改变，这为改良小麦品质提供了新思路。

技术体系突破传统瓶颈，具有三个显著创新点：首先，建立胚胎特异性转化系统，通过单倍体诱导系HIPE筛选白化胚胎，解决了单倍体组织难以纯化的难题；其次，开发双标记检测技术，将GUS报告基因与RUBY色素标记结合，实现转化效率的实时可视化监测；最后，构建CRISPR/Cas9与sgRNA协同编辑体系，在单倍体胚胎中同时完成外源基因插入和内源基因敲除。

应用价值方面，该体系将小麦转基因培育周期从传统5-7年缩短至1-2年。以TaWaxy编辑为例，传统方法需经历3-4次自交才能获得纯合体，而本体系通过单倍体胚胎转化+染色体加倍一步到位，使纯合体获得时间缩短至9个月。经田间试验验证，编辑后的植株在籽粒硬度、加工品质等关键指标上较野生型提升27%-34%，为开发优质高强小麦新品种提供了技术支撑。

研究还揭示了单倍体胚胎的转化优势：相较于二倍体胚胎，单倍体细胞具有更活跃的表观遗传调控系统，外源基因整合效率提高1.8倍。分子机制研究表明，单倍体胚胎的端粒保护机制更完善，使得大片段载体（>8kb）的转化效率稳定在60%以上。此外，研究团队发现RUBY色素标记系统在小麦中的表达具有组织特异性，在叶片、茎秆等器官的表达强度差异可达3-5倍，这为精准基因表达调控提供了新工具。

技术优化方面，研究团队对比了三种染色体加倍方案：传统秋水仙素处理（10mmol/L）、新型有机酸处理（0.12mmol/L propyzamide）以及物理诱导方法。实验数据显示，propyzamide处理在效率（57.1%）和植株存活率（82.3%）方面均优于传统秋水仙素处理（54.3%存活率）。同时开发出基于流式细胞术的快速倍性鉴定系统，将鉴定时间从48小时压缩至4小时，鉴定准确率提升至99.2%。

未来研究方向建议：1）构建小麦全基因组CRISPR编辑靶点数据库，筛选高编辑效率的基因位点；2）优化多基因共编辑策略，开发同时编辑3-5个基因的 "__ "__型CRISPR系统；3）研发基于纳米颗粒的基因编辑递送系统，提高外源基因的靶向性。该技术体系已成功应用于抗逆基因（如TaNBS-LRR）的精准编辑，获得抗旱指数提升40%的稳定突变体。

本研究为全球小麦遗传改良提供了重要技术范式。根据联合国粮农组织数据，当前全球小麦单产增长率仅为0.7%/年，远低于人口增长（1.1%/年）和需求增速（1.8%/年）。本技术体系通过缩短育种周期、提高编辑精准度，有望将优质小麦品种研发周期从10-15年压缩至3-5年，对实现2030年小麦单产提升20%的目标具有重要战略意义。