《Horticulture Research》：Callus-mediated plant regeneration and CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis in Oenanthe javanica
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编辑荐读：针对水芹长期无性繁殖导致遗传狭窄、难以常规育种的痛点，作者以叶柄为外植体优化愈伤再生，并整合CRISPR/Cas9构建OjPDS四靶点敲除系统，获得10/14编辑植株（效率1.7%），其中90%在T1位点发生突变并呈现白化或嵌合表型。研究首次建立水芹基因编辑平台，为功能基因验证与优异种质创制提供即时可用的“分子刀”。
江南水畔的“青香水芹”自古药食同源，却因种子休眠、发芽率低，只能依赖茎段扦插扩繁。年复一年，病毒积累、种性退化，传统杂交更是“寸步难行”，育种家手里几乎没有可供操作的变异材料。面对这道死结，扬州大学/南京农业大学联合团队把目光转向“组织培养+基因编辑”——只要能让任一细胞重获全能性，就能把精准突变快速嫁接到整个植株，实现“从0到1”的种质创新。
研究人员先系统摸索水芹愈伤诱导的最佳“配方”。取无菌苗叶柄、叶片、根三种外植体，比较Murashige & Skoog（MS）与Gamborg B5两种基础培养基，再叠加不同浓度2,4-D、NAA、6-BA组合。结果B5 + 0.5 mg/L 2,4-D + 1.0 mg/L 6-BA诱导率最高；若转为增殖，则把2,4-D升至1.0 mg/L、6-BA降至0.5 mg/L；进一步分化成苗，则需回到MS + 0.5 mg/L NAA + 2.0 mg/L 6-BA。至此，一条“诱导—增殖—分化”的完整再生流水线被打通，为后续遗传转化奠定先决条件。
有了高效再生，团队立即把CRISPR/Cas9“瞄准镜”对准类胡萝卜素合成路径的“报告基因”——八氢番茄红素脱饱和酶基因（PDS）。该基因一旦失效，植株因无法合成有色类胡萝卜素而呈现肉眼可辨的白化，是衡量编辑效率的“可视化标尺”。作者先在水芹T2T基因组中锁定单拷贝Oj17G000040.1，命名为OjPDS；继而用CRISPR-GE在线工具在前4个外显子各布置1个靶点（T1–T4），并分别由拟南芥AtU3b、AtU3d、AtU6-1、AtU6-29启动子驱动sgRNA，以提高复合剪切效率。四合一表达盒被装进pYLCRISPR/Cas9Pubi-H骨架，获得重组载体OjPDS-2300GN-Ubi-Cas9，电击转入农杆菌GV3101。
以叶柄为受体，603块外植体经侵染、共培、筛选（卡那霉素50 mg/L + 羧苄青霉素300 mg/L）后，通过体细胞胚胎发生途径再生出14株独立植株，表型呈绿色、白化或嵌合。CTAB法提取总DNA，对T1–T4区段PCR扩增并直接测序或克隆测序，结果显示10株发生目标突变，编辑效率1.7%。其中T1（AtU3b驱动）突变率90%，出现2个纯合与4个双等位突变；T2（AtU3d驱动）70%，3个纯合；T3（AtU6-1驱动）仅20%；T4（AtU6-29驱动）与T2持平。不同启动子造成的效率差异提示AtU3b在伞形科作物中具有更优的转录活性。最终，纯合、双等位、嵌合与野生型各占40%、20%、20%、40%，与表型观察高度吻合。
关键技术方法
水芹无菌苗叶柄愈伤诱导与分化体系优化
基于T2T基因组BLAST检索单拷贝OjPDS并设计四靶点sgRNA
多启动子（AtU3b/AtU3d/AtU6-1/AtU6-29）驱动的CRISPR/Cas9载体构建
农杆菌介导的叶柄遗传转化与卡那霉素筛选
PCR-测序与克隆测序结合的突变检测
研究结果
愈伤诱导与植株再生
通过比较外植体、基础培养基与植物生长调节剂，确定B5 + 0.5 mg/L 2,4-D + 1.0 mg/L 6-BA为最佳诱导条件；增殖阶段提高2,4-D至1.0 mg/L；分化阶段改用MS + 0.5 mg/L NAA + 2.0 mg/L 6-BA，可稳定获得完整再生植株。
OjPDS基因鉴定与靶点设计
在已发布的水芹端粒到端粒（T2T）基因组中，以胡萝卜DcPDS为探针BLAST得到唯一候选Oj17G000040.1，命名为OjPDS。其编码蛋白含phytoene-desat结构域，参与类胡萝卜素合成。
CRISPR/Cas9载体构建
将靶向T1–T4的sgRNA分别置于AtU3b、AtU3d、AtU6-1、AtU6-29启动子下，四盒串联后插入pYLCRISPR/Cas9Pubi-H，获得OjPDS-2300GN-Ubi-Cas9双元载体。
遗传转化与突变检测
603块叶柄外植体经农杆菌侵染及抗生素筛选，再生14株阳性植株。测序显示10株携带突变，T1、T2、T4效率显著高于T3，且T1可产生高比例纯合突变。
结论与讨论
该研究首次在水芹中打通“愈伤—再生—CRISPR/Cas9”全链条，实现1.7%的稳定编辑效率，并通过PDS白化表型直观验证。AtU3b启动子在伞形科作物基因编辑中的优势被再次确认；同时，建立的再生体系同样适用于其他功能基因或多位点编辑，为破解水芹无性繁殖造成的遗传瓶颈提供了可复制的技术范式。未来，借助这一平台，可快速定向改造风味、抗病、抗逆等关键性状，加速水芹从传统无性繁殖迈向精准分子育种的新时代。
