单细胞分辨率下揭示神经外胚层来源的人虹膜肌肉特征及多能干细胞眼模型构建

《Nature Communications》：Neuroectoderm-derived iris muscle characterization at the single-cell resolution in native human iris and a pluripotent stem cell eye model

本研究针对神经外胚层来源的虹膜肌肉发育机制不清的问题，通过单细胞RNA测序技术对比分析成人虹膜组织与hPSC（人多能干细胞）分化的SEAM（自形成外胚层自主多区）眼模型，首次建立了人虹膜肌肉的基因特征谱，证实PAX6+/ACTA2+共表达为虹膜肌肉标志，并发现干细胞模型分化的虹膜肌肉细胞具有乙酰胆碱响应功能，为研究虹膜相关疾病提供了新模型。

　　

眼睛作为人体最精密的感官器官，其发育机制一直是发育生物学研究的焦点。虹膜作为眼球前段的重要结构，通过肌肉的收缩和舒张调节瞳孔大小，像相机的光圈一样控制进光量，保护视网膜免受强光损伤。然而有趣的是，虹膜肌肉并非像身体大多数肌肉那样来源于中胚层，而是起源于神经外胚层的视杯远端尖端，这一特殊的发育起源使其成为研究神经外胚层向肌肉细胞分化的独特模型。

尽管早期研究通过电镜观察发现虹膜肌肉细胞含有色素颗粒，提示其可能来源于色素上皮，但关于人虹膜肌肉发育的分子机制至今仍不明确。PAX6基因突变会导致虹膜发育不全（无虹膜症），ACTA2基因突变则会引起包括虹膜肌肉发育异常在内的多系统平滑肌功能障碍综合征。然而，由于人眼组织样本获取困难，以及缺乏合适的体外模型，科学家们对虹膜肌肉的发育过程和相关疾病机制的理解一直存在空白。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员首次在单细胞分辨率下系统描绘了成人虹膜组织的细胞组成特征，并利用人多能干细胞（hPSC）成功构建了能够分化出虹膜肌肉的眼球类器官模型。通过对比分析天然虹膜组织与干细胞分化模型，研究团队揭示了虹膜肌肉的特异性基因表达特征，为研究虹膜发育和相关疾病提供了重要平台。

研究采用了多种关键技术方法：通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析3例成人供体虹膜组织；利用hPSC分化技术构建SEAM（自形成外胚层自主多区）眼模型；采用免疫荧光染色验证蛋白共表达；通过钙成像技术检测细胞功能；使用成像流式细胞术进行定量分析；并整合分析单细胞转录组数据集比较体内外模型相似性。

虹膜平滑肌层特征

研究人员首先通过免疫荧光染色证实，与小鼠虹膜类似，成人虹膜中层的平滑肌细胞共表达PAX6和αSMA（由ACTA2基因编码），同时表达平滑肌标志SM22a（由TAGLN基因编码），而虹膜色素上皮（IPE）层仅表达PAX6，基质层则为PAX6阴性。这一发现首次在蛋白水平验证了人虹膜肌肉的神经外胚层起源特征。

天然成人虹膜的特征

通过对3例成人供体虹膜组织进行单细胞RNA测序，研究人员鉴定出5种主要细胞类型：基质黑色素细胞（M-Str）、非黑色素基质细胞（NM-Str）、巨噬细胞、血管细胞和虹膜肌肉细胞。虹膜肌肉细胞特异性高表达PAX6、ACTA2、TAGLN等平滑肌相关基因，同时表达与色素合成相关的DCT和MITF基因，支持了虹膜肌肉来源于色素上皮的假说。此外，还发现了虹膜肌肉特异性表达表面标志物THY1（CD90）、AQP1和FZD7。

SEAM眼球模型中虹膜肌肉的分化

研究人员对hPSC进行定向分化，形成了具有同心圆区域结构的SEAM类器官。在分化第6周，在PAX6高表达的区域2（对应视杯）与区域3的边界处发现了共表达PAX6和αSMA的细胞群，这些细胞周围环绕着色素区域，与天然虹膜中虹膜肌肉与色素上皮的解剖位置关系相似。通过成像流式细胞术定量分析，证实约7.6%的SEAM细胞为PAX6⁺/αSMA⁺的虹膜肌肉前体细胞。

体外hPSC来源的虹膜肌肉与天然成人虹膜肌肉的相似性

单细胞转录组数据整合分析显示，SEAM模型中的视杯远端（DOC）细胞群与天然虹膜肌肉细胞具有高度相似性，均特异性共表达PAX6和ACTA2。虽然干细胞分化的虹膜肌肉细胞中某些成熟标志物（如MYH11、MYLK）表达水平较低，但眼场相关基因（PAX6、LHX2、RAX）表达模式与天然组织一致，支持其神经外胚层起源。

PAX6基因敲除对虹膜肌肉分化的影响

在PAX6基因敲除（KO）的SEAM模型中，虹膜肌肉分化显著受损，缺乏色素沉着，且OTX2⁺/αSMA⁺的眼场肌肉细胞消失，这与小鼠模型中PAX6缺失导致虹膜发育异常的表型一致，证实了PAX6在虹膜肌肉命运特化中的关键作用。

SEAM来源的虹膜肌肉细胞对乙酰胆碱的响应

通过钙成像技术证实，从MYH11报告细胞系分化的虹膜肌肉细胞在乙酰胆碱（ACh）刺激下产生明显的钙瞬变，表明这些细胞具有功能性平滑肌的特征，能够响应神经递质刺激。

这项研究首次在单细胞分辨率下系统描绘了人虹膜肌肉的转录组特征，建立了可靠的体外分化模型，并揭示了PAX6在虹膜肌肉特化中的核心作用。研究发现不仅证实了虹膜肌肉的神经外胚层起源，还发现了其表达色素合成相关基因的特殊属性，为理解虹膜发育生物学提供了新视角。

SEAM模型成功复现了虹膜肌肉的分化过程，为研究无虹膜症、Axenfeld-Rieger综合征、Waardenburg综合征等虹膜相关疾病提供了强大平台。特别值得注意的是，该模型为研究增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）中视网膜色素上皮向肌肉表型转分的异常过程提供了独特窗口，这种神经外胚层向肌肉的异常转化与虹膜肌肉的正常发育过程有着有趣的相似性。

这项工作的意义不仅在于增进了对眼发育生物学的理解，更重要的是建立了一个可用于疾病建模和药物筛选的平台。未来研究人员可以利用这一模型研究特定基因突变如何影响虹膜发育，为相关眼病的治疗提供新思路。随着干细胞技术和类器官模型的不断发展，这类研究有望推动再生医学在眼科疾病治疗中的应用进展。