内含子序列整合降低Cas9转基因沉默：提升基因编辑稳定性的新策略

《Nature Communications》：Reduced Cas9 transgene silencing by incorporation of intron sequences

本研究针对外源基因（尤其是Cas9）在哺乳动物细胞中易被表观沉默的技术瓶颈，通过系统性地在表达框架中引入内含子序列，显著提升了转基因的长期稳定性。实验表明，长度超过2 kb且富含T碱基的内含子（如HBB IVS2）与染色质开放元件（UCOE）协同作用，可同时从RNA和DNA层面抑制HUSH复合物介导的沉默机制。该策略成功增强了CRISPRa/dCas9系统对内源基因（如CD2、CD14、CD28）的激活效率，为基因治疗和合成生物学提供了普适性优化方案。

　　

在基因编辑和合成生物学领域，实现外源基因的稳定表达始终是核心挑战之一。尤其对于CRISPR技术中常用的Cas9蛋白，其编码序列较长（约4.9 kb），易被细胞内的表观遗传沉默机制识别为“外来入侵者”而关闭表达。这种沉默现象在干细胞、免疫细胞等特定细胞类型中尤为显著，严重限制了基因编辑效率和治疗应用。近年来研究发现，人类沉默中枢（HUSH）复合物会特异性靶向缺乏内含子的长链转录本，类比其对LINE-1逆转录转座子的识别机制。然而，能否通过模拟天然基因的结构特征来“伪装”转基因以逃逸沉默，仍是未解之谜。

为此，斯坦福大学Michael C. Bassik团队在《Nature Communications》发表研究，系统探索了内含子序列对抗转基因沉默的潜力。研究人员利用大丝氨酸重组酶Cp36将Cas9-BFP融合基因随机整合至K562、HEK293T、人诱导多能干细胞（hiPSC）及小鼠肺癌LLC细胞基因组中，并通过流式细胞术长期监测表达稳定性。结果发现，无内含子的Cas9-BFP在四周内沉默比例高达40%-80%，而插入人β-珠蛋白第二内含子（HBB IVS2）后，沉默现象显著缓解。

关键技术方法

研究通过Cp36重组酶实现转基因的随机整合，避免慢病毒载体对内含子的剪切；利用流式细胞术分选BFP⁺细胞并追踪表达衰减；采用RT-qPCR量化转录本水平；通过CRISPRa系统（SAM-dCas9-NFZ）评估内含子对基因激活效力的影响；结合生物信息学分析内含子长度、T含量、RNA结合蛋白 motif 等特征与抗沉默能力的关联。

内含子位置与序列特性的功能图谱

为明确内含子的作用规律，团队将HBB IVS2置于Cas9-BFP转录单元的不同位置（5'UTR、编码区、3'UTR等）。

实验表明，无论内含子位于何处，均能显著抑制沉默（P<0.0003），但位于编码区间时蛋白表达量最高。值得注意的是，位于启动子上游或3'UTR时保护效果减弱，证实内含子需位于转录单元内才能发挥作用。

进一步筛选涵盖不同长度（200 bp-2 kb）和序列特征的内含子面板后发现，长度超过2 kb的内含子（如PSMD14 IVS2）抗沉默效果最优，且其效率与T含量正相关（R²=0.573）。

值得注意的是，长度仅408 bp的HNRNPK IVS3因高T含量和丰富RNA结合蛋白 motif，表现堪比长内含子，提示序列特性可补偿长度不足。

多层级抗沉默策略的协同效应

鉴于HUSH复合物主要作用于RNA层面，团队尝试联合DNA层级调控元件（如绝缘子cHS4或染色质开放元件A2UCOE）。

结果显示，cHS4单独使用无效，而UCOE可独立降低沉默；当UCOE与HBB IVS2联用时，在K562和HEK293T细胞中均产生协同效应（P=0.0005），使Cas9-BFP表达细胞比例提升至90%以上，且平均荧光强度显著增加。该组合在Cas12a系统中同样有效，证实策略的普适性。

从稳定性到功能增强的应用验证

研究最终评估了内含子对CRISPRa功能的影响。在HEK293T细胞中，含HBB IVS2的SAM-dCas9-NFZ构建体转录本量提升11.6倍，并显著增强CD2、CD14、CD28等内源基因的激活效果（最高提升15.4倍）。

原本无效的sgRNA（如CD28-sg1）在含内含子系统中恢复活性，凸显了高表达水平对表观编辑工具的重要性。

结论与展望

本研究揭示了内含子序列通过模拟天然基因结构逃逸HUSH识别的分子机制，并确立了“长度＞2 kb”与“高T含量”作为理想内含子的关键指标。更重要的是，通过将RNA层级（内含子）与DNA层级（UCOE）调控元件耦合，实现了转基因表达稳定性的突破。该策略不仅解决了Cas9沉默难题，更为大片段转基因（如碱基编辑器、CAR-T）的持久表达提供了通用优化框架，有望推动基因治疗与合成生物学应用的标准化进程。