工程化CRISPR关联IscB系统开发微型基因组编辑工具及其在哺乳动物细胞和胚胎中的应用

《Nature Communications》：Engineering a CRISPR-associated IscB system for developing miniature genome-editing tools in human cells and mouse embryos

本研究针对传统CRISPR-Cas系统尺寸过大难以实现单AAV递送的问题，对识别灵活TAM（NAC）的DellscB系统进行蛋白与sgRNA工程化改造，获得活性提升48.9倍的enDellscB编辑器，并成功开发出微型碱基编辑器ICBE/IABE和小鼠疾病模型。该研究为体内基因治疗提供了新型微型工具，发表于《Nature Communications》。

　　

基因组编辑技术CRISPR-Cas系统自问世以来彻底改变了生命科学研究的格局，但传统Cas9和Cas12a蛋白较大的尺寸（通常超过1000个氨基酸）限制了其在体内的应用，尤其是通过腺相关病毒（AAV）载体的递送。AAV作为FDA批准的常用核酸药物递送载体，其装载上限仅为4.7 kb，这使得开发紧凑型基因编辑工具成为当务之急。近年来，科学家们陆续发现了Cas12f、Cas12j等微型核酸酶，但它们在编辑效率和适用范围上仍存在局限。IscB作为Cas9的推测祖先蛋白，尺寸仅为400个氨基酸左右，具有天然的小尺寸优势，但其在真核细胞中的编辑活性较低，且已知的OgeulscB系统需要复杂的靶标相邻基序（TAM, NWRRNA），限制了其应用范围。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，张飞等人聚焦于从特拉华湾水生样本宏基因组中鉴定出的CRISPR关联IscB系统——DellscB。该系统识别更灵活的TAM（NAC），且尺寸更为紧凑（457个氨基酸）。研究人员通过系统的蛋白质和sgRNA工程化改造，显著提升了DellscB的编辑活性，并开发了基于该系统的微型碱基编辑器，最终在人类细胞和小鼠胚胎中验证了其高效编辑能力。

研究团队采用蛋白质结构预测（AlphaFold2）、多位点序列比对、sgRNA scaffold截短与优化、荧光报告系统筛选、高通量测序分析、GUIDE-seq全基因组脱靶评估、小鼠胚胎显微注射等技术方法。人类胚胎肾293T（HEK293T）细胞和小鼠神经瘤2a（N2a）细胞作为主要体外模型，C57BL/6J小鼠胚胎用于体内功能验证。

DellscB在E.coli和人类细胞中实现程序化质粒DNA切割

研究人员首先通过质粒干扰实验证明DellscB能在大肠杆菌中高效切割质粒DNA，其效率与SpCas9相当。通过分析DellscB的非编码RNA（ncRNA）结构，团队截断了直接重复/反重复区域并去除多T信号，获得了能在真核细胞中功能的sgRNA-V1版本。荧光报告系统检测显示，野生型DellscB在HEK293T细胞中的质粒切割效率仅为5%，且N端融合核定位信号（NLS）会显著抑制其活性。

工程化DellscB蛋白提升哺乳动物细胞编辑效率

通过将高活性enIscB突变位点映射至DellscB，并结合多序列比对筛选出122个精氨酸替换突变和66个自然发生突变，研究人员获得了14个活性提升超过1.2倍的变异体。其中S97K突变显示最高活性，最终组合10个变异体（S97K、V396K、E317R、C12R、Q340K、W117F、A142P、S100A、G104S、S436R）形成的DellscB-V10.1，活性比野生型提高约5倍。

工程化DellscB sgRNA scaffold进一步提升活性

研究人员对sgRNA-V1进行茎环截短和稳定性优化，发现截短stem1.3和stem2区域（sgRNA-V2/V2.1）及引入假结区柔性突变（U205A，sgRNA-V4）均可提升活性。最终组合版本sgRNA-V5与DellscB-V10.1形成的enDellscB系统，在报告基因检测中活性超过enIscB-T5E。

评估enDellscB和enDellscB-T5E的基因组编辑效率和精确性

在24个内源基因位点上，enDellscB的编辑效率比野生型DellscB平均提高48.9倍。enDellscB-T5E的编辑效率（54.27±28.07%）与enIscB-T5E（53.70±29.84%）相当。 indel模式分析显示enDellscB产生约90 bp的宽缺失范围，而enDellscB-T5E的缺失范围更窄（约60 bp）且几乎不产生插入事件。 Cas-OFFinder预测和GUIDE-seq全基因组脱靶分析表明，enDellscB-T5E在脱靶位点的编辑比例更高，提示T5E融合在提高靶向活性的同时也可能增加脱靶风险。

基于enDellscB nickase开发碱基编辑器

通过突变RuvC（D60A）或HNH（H226A）结构域活性位点获得nickase版本，研究人员构建了C端融合hAPOBEC3A（高保真版本）和2xUGI的微型胞嘧啶碱基编辑器（ICBE），以及C端融合TadA二聚体的微型腺嘌呤碱基编辑器（IABE）。ICBE的编辑窗口为靶点位置-1至12，最高效率达49.26±23.22%；IABE的编辑窗口为-4至12，最高效率为60.22±22.47%，两者均表现出与基于enIscB的编辑器相当的效率。

enDellscB和enDellscB-T5E高效生成小鼠模型

通过向小鼠受精卵共注射enDellscB/enDellscB-T5E mRNA和靶向酪氨酸酶基因（Tyr）的sgRNA，成功获得毛色变白的F0代小鼠。enDellscB和enDellscB-T5E编辑组的平均indel效率分别为96.77%和98.67%，证明其在胚胎中具有高效编辑能力。部分小鼠出现黑白相间的毛色斑块，基因组测序证实其为嵌合体。

研究结论表明，通过对DellscB系统的蛋白质和sgRNA进行多维度工程化改造，研究人员成功开发了具有高效编辑能力的enDellscB系列工具。与OgeulscB相比，DellscB具有更灵活的TAM（NAC）和更高的靶向密度（人类CDS区域内为10.10% vs 7.39%）。基于结构预测分析发现，N端融合NLS或脱氨酶可能通过空间位阻影响核糖核蛋白复合物稳定性，这为后续优化提供了方向。该研究不仅扩展了微型基因编辑工具箱，也为基于AAV递送的体内基因治疗提供了新工具，同时为工程化RNA引导核酸酶（RGN）提供了可借鉴的策略。值得注意的是，编辑窗口较宽和脱靶效应仍是未来应用中需要关注的问题，通过插入REC结构域或内部融合脱氨酶可能有望进一步优化编辑器性能。