中国东部地区儿童重症社区获得性肺炎中肠道病毒D68 B3和D3亚分支的流行与遗传特征研究（2021-2024）

《Scientific Reports》：Subclade B3 and D3 enterovirus D68 among children with severe community-acquired pneumonia in China, 2021 to 2024

本研究针对COVID-19疫情前后中国儿童重症社区获得性肺炎（CAP）中肠道病毒D68（EV-D68）的流行状况及遗传变异开展系统监测。通过对2842例住院患儿的呼吸道样本进行实时RT-PCR检测和基因测序，发现EV-D68总体检出率为0.7%，其中2024年检出率显著升高至1.1%。研究首次报道了新型D3亚分支病毒与重症肺炎的密切关联，并发现VP1蛋白关键抗原位点（BC/DE/GH环）存在H99D、K168E等重要突变，为EV-D68的病原学研究和临床防控提供了重要科学依据。

　　

在2014年全球范围内暴发大规模感染后，肠道病毒D68（Enterovirus D68, EV-D68）作为一种新兴的呼吸道病原体，逐渐成为威胁儿童健康的重要病原。与传统的肠道病毒不同，EV-D68更倾向于引起呼吸道症状，严重时可导致重症肺炎、急性弛缓性脊髓炎（Acute Flaccid Myelitis, AFM）等严重并发症。值得注意的是，EV-D68的流行呈现出明显的隔年高发模式，然而2020年预期的流行高峰因COVID-19疫情防控措施的实施而未出现，这使得病毒在人群中的传播动态和进化轨迹发生了变化。

随着疫情防控措施的调整，EV-D68是否会重新活跃并引发新的流行，特别是是否会出现毒力更强的新变异株，成为全球传染病监测领域关注的焦点。以往的研究表明，基于VP1基因的进化分析可将EV-D68分为A、B、C、D四个基因型，其中自2014年以来，B3亚分支逐渐取代了D1和B2，成为引起儿童严重呼吸道感染和神经系统并发症的主要流行株。而近年来，D3亚分支病毒在中国和西班牙等地的散发病例中也被检测到，并与严重呼吸道感染相关，这引发了科研人员对D3亚分支可能引发新流行周期的担忧。

在此背景下，由复旦大学附属儿科医院、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所等多家机构联合开展的研究，对2021年至2024年间中国东部地区住院的社区获得性肺炎（Community-Acquired Pneumonia, CAP）儿童进行了系统的EV-D68监测。该研究旨在明确COVID-19疫情前后EV-D68在中国的流行特征、基因变异情况及其与儿童重症肺炎的关联，研究成果发表于《Scientific Reports》期刊。

研究人员采用了多种关键技术方法开展本研究。研究团队收集了来自上海、山东、福建、浙江和江苏等地六家医院2842例住院CAP儿童的呼吸道样本（包括鼻咽拭子、痰液和支气管肺泡灌洗液），采用实时逆转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）进行EV-D68核酸检测，对阳性样本进行VP1基因测序和系统进化分析，并对部分毒株进行了病毒分离培养和电子显微镜形态学鉴定。此外，研究还收集了患者的临床资料，包括重症监护室（ICU）入住率、机械通气需求、肺部CT影像等，以分析病毒感染与疾病严重程度的关联。

EV-D68检测

研究结果显示，在2842例CAP患儿中，重症肺炎占25.3%（719/2842）。EV-D68总体检出率为0.7%（21/2842），这些阳性样本包括6例鼻咽拭子、8例痰液和7例支气管肺泡灌洗液（BALF）。阳性患儿的年龄中位数为5.0岁（IQR：3.6-8.0岁），平均住院时间为6.0天（IQR：5.0-8.0天）。年度检测率分析显示，2021年为0%（0/576），2022年为1.2%（6/479），2023年为0.2%（1/508），2024年为1.1%（14/1279），呈现出2022年和2024年两个明显的检出高峰，符合EV-D68的隔年流行特征。季节分布上，秋季检出率最高（13例，占秋季样本的1.3%），冬季未检出病例。

特别值得注意的是，21例EV-D68阳性病例中，9例（42.9%）为重症肺炎，其中2022年重症肺炎患儿中的检出率为1.2%（1/83），2024年升至2.1%（8/381）。2024年的8例重症肺炎中，7例来自复旦大学附属儿科医院（上海），1例来自江苏省，且上海的7例患者均采集了BALF样本进行检测。病毒合并感染情况较为常见，85.7%（18/21）的EV-D68阳性样本中同时检测到其他呼吸道病毒，4份样本还合并细菌或真菌病原体感染。

严重EV-D68病例描述（2024年）

2024年检出的EV-D68阳性病例中，出现了两例具有重要临床意义的特殊病例。一例为7岁男童，患有严重CAP合并中枢神经系统（CNS）感染，临床表现为发热、头痛和嗜睡，但无惊厥或意识障碍。头颅磁共振成像和脑电图结果正常，两次脑脊液（CSF）检查显示白细胞计数分别为15×10⁶/L和20×10⁶/L，符合病毒性脑膜炎改变，但脑脊液中未检测到EV-D68 RNA。另一例为10岁女童，因呼吸衰竭需要高流量鼻导管氧疗，在其BALF、血清和粪便样本中均检测到EV-D68，实时RT-PCR的Ct值分别为19.1、36.8和39.0，并通过宏基因组下一代测序（mNGS）确认。这两例病例的肺部CT影像均显示明显的肺实变和肺不张改变。

病毒基因型

研究人员成功对21株EV-D68病毒进行了基因测序，获得了17条部分VP1基因序列和4条全基因组序列。系统进化分析显示，这21株病毒中，15株属于B3亚分支，6株属于D3亚分支。B3毒株在2022年（6株）、2023年（1株）和2024年（8株，包括7岁男童的毒株）均有检出；而所有6株D3毒株均来自2024年，其中包括10岁女童的毒株，其中5株来自重症CAP患儿的BALF样本，1株来自痰液样本。基于VP1基因和全基因组的进化分析结果一致。

病毒鉴定

研究团队将临床分离的EV-D68毒株接种至横纹肌肉瘤（RD）细胞进行培养，接种72小时后可观察到明显的细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、脱落和死亡。透射电子显微镜观察显示病毒颗粒为无包膜的球形结构，直径约20-30纳米，符合肠道病毒的典型形态特征。

序列分析

对20条EV-D68 VP1序列的分析显示，这些毒株之间的核苷酸同源性为84.9%-99.8%，氨基酸同源性为90.9%-100.0%。与1962年的参考株Fermon（AY426531）相比，VP1蛋白的21个氨基酸位点发生了替换，其中主要集中于BC环（8个替换）、DE环（5个替换）和GH环（1个替换）等抗原表位区域。值得注意的是，发现了H99D、K168E和E169K等点突变。D3亚分支毒株在BC环区域（第95-99位氨基酸）与B3毒株存在明显差异。然而，对比分析未发现与临床毒力明确相关的独特突变位点。

讨论与结论

本研究通过为期四年的系统监测，揭示了中国东部地区儿童CAP中EV-D68的流行规律和分子特征。研究发现，EV-D68在COVID-19疫情后继续传播，并在2022年和2024年出现两个检出高峰，恢复了其隔年流行的特征。与2013-2020年监测数据相比，阳性患儿的平均年龄有所上升（从1.3岁升至5.0岁），这可能与疫情期间幼儿接触病毒机会减少有关。

尤为重要的是，本研究首次报道了D3亚分支EV-D68在2024年中国儿童重症肺炎中的显著增加，并且与病毒血症病例相关。在重症CAP患儿BALF样本中高频率检测到D3毒株，提示其可能与下呼吸道感染和严重疾病相关。病毒在RD细胞中成功分离以及电镜下的形态学确认，为后续病毒生物学特性研究奠定了基础。

VP1蛋白抗原位点的氨基酸变异，特别是BC、DE和GH环区域的突变，可能影响病毒的抗原性和受体结合特性，进而潜在影响其传播能力和致病性。虽然本研究未直接证实这些突变与毒力增强的因果关系，但为后续功能研究提供了重要线索。

综上所述，本研究证实了EV-D68 B3和D3亚分支在中国儿童，特别是重症肺炎患儿中的持续传播和进化。D3亚分支在2024年的活跃和与严重疾病的关联，提示需要加强对该变异株的监测和警惕。这些发现对理解EV-D68的流行病学、进化动力学和临床致病性具有重要意义，为制定相应的预防和控制策略提供了科学依据。持续、广泛的医院基于病毒监测对于早期发现疫情、识别新发变异株和有效应对潜在的公共卫生威胁至关重要。