基于RMCE技术的dFlpTag工具：实现果蝇内源蛋白同步标记与细胞示踪的新方法

《Scientific Reports》：dFlpTag, a RMCE-based tool for simultaneous endogenous protein tagging and cell labeling in Drosophila

本刊推荐：为解决内源蛋白标记与细胞来源示踪的同步难题，研究人员开发了基于重组酶介导的盒式交换（RMCE）的dFlpTag系统。该工具通过翻转式蛋白捕获模块设计，可在果蝇中实现条件性蛋白标记（如Brp、Dlg1、Dpr12）与GAL4驱动细胞标记的同步激活，为神经环路蛋白定位研究提供了创新方案。

　　

在生命科学研究中，精确解析蛋白质在细胞内的表达模式和动态分布是理解其生物学功能的关键。对于在复杂组织中表达的蛋白质，特别是在具有高度极化结构的神经元中，传统的免疫染色方法常因抗体特异性不足而受限。虽然通过外源表达标记蛋白能部分解决这一问题，但这种方式无法完全模拟内源基因的表达调控，可能导致表达水平异常或亚细胞定位失真。因此，开发能够在内源基因位点进行精确蛋白标记的技术具有重要价值。

果蝇作为模式生物，其丰富的遗传学工具为内源蛋白标记提供了独特优势。其中，MiMIC（Minos介导的整合盒）和CRIMIC（CRISPR介导的整合盒）系统通过在内含子中插入可交换的盒式结构，为大规模蛋白标记奠定了基础。然而，现有技术仍存在局限：一方面，传统蛋白标记方法难以同步示踪表达该蛋白的细胞来源；另一方面，对于在轴突末梢等远离胞体的区域富集的蛋白，准确识别其表达细胞尤为困难。这些挑战在神经科学研究中尤为突出，因为神经元通常具有复杂的形态结构，蛋白可能被运输到距离胞体很远的区域。

为了解决这些难题，来自浙江大学医学院附属儿童医院和比利时鲁汶大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种名为dFlpTag（双重FlpTag）的新型遗传学工具，该工具基于RMCE（重组酶介导的盒式交换）技术，能够同时实现内源蛋白的条件性标记和细胞来源示踪。

研究人员运用了多项关键技术方法：利用RMCE技术将dFlpTag盒式结构整合到特定基因的MiMIC或CRIMIC位点；通过FLP-FRT系统实现蛋白捕获模块的条件性翻转；采用GAL4/UAS系统进行细胞特异性标记；使用免疫荧光染色和共聚焦显微镜进行蛋白定位验证。研究材料包括果蝇Brp^MI02987、Dlg1^MI06353和Dpr12^MI01695等MiMIC品系。

dFlpTag标签预突触蛋白Brp

研究人员首先选择突触前支架蛋白Bruchpilot（Brp）作为验证对象。通过将dFlpTag-GFSTF或dFlpTag-smGFP::HA质粒注射到Brp^MI02987胚胎中，成功获得了组成型和条件型标记品系。在组成型品系中，GFSTF标记的Brp在幼虫腹神经索和成虫脑部的神经纤维网中特异性表达，与已发表的Brp标记品系和抗Brp（Nc82）染色结果一致。在神经肌肉接头处，标记的Brp甚至能够显示单个活性区。相比之下，smGFP::HA标签的GFP信号较弱，但抗HA染色产生了高度特异性信号。在条件型品系中，只有在神经元特异性表达FLP时，才能在神经纤维网中检测到GFP标记的Brp，同时DsRed标记了神经元胞体和突起。使用R13F02-GAL4在蘑菇体Kenyon细胞中特异性表达FLP时，DsRed标记了Kenyon细胞胞体，而smGFP::HA标记的Brp主要富集在Kenyon细胞轴突中。

条件性Dlg1标记揭示突触后和上皮定位

Discs large 1（Dlg1）是一种富集于神经系统突触后区的膜相关鸟苷酸激酶。研究人员通过类似方法生成了条件型Dlg1品系。在幼虫体壁肌肉中，当使用Mef2-GAL4在肌肉中表达FLP时，抗HA和抗Dlg1染色在神经肌肉接头的突触后特化区显示出高度重叠的表达模式，DsRed特异性在肌肉中检测到。在幼虫翅成虫盘中，Dlg1定位于上皮细胞膜上。使用ap-GAL4在翅囊背半部表达UAS-FLP时，HA和DsRed染色特异性在翅盘的相应区域检测到，HA信号优先位于细胞膜上。有趣的是，与腹侧细胞（dFlpTag关闭侧）相比，背侧上皮中检测到更高水平的Dlg1，表明dFlpTag盒式结构的内含子插入即使在与宿主基因转录相反的方向上也可能干扰基因表达。

dFlptag标记跨膜蛋白Dpr12于KC轴突区室

Dpr12（缺陷性吻伸反应12）是一种跨膜蛋白，在蘑菇体γ4/5区室发育中起关键作用。研究人员成功生成了Dpr12的组成型和条件型dFlpTag品系。在组成型品系中，GFSTF标记的Dpr12在蛹和成虫脑部的γ4/5区室中富集，与已发表的蛋白捕获品系表达模式一致。smGFP::HA标记的Dpr12在蛹脑中显示区室特异性定位，但在成虫蘑菇体中分布更广。当使用泛神经元R57C10-GAL4或Kenyon细胞特异性R13F02-GAL4表达FLP时，在γ4区室中检测到GFP标记的Dpr12。相反，当使用R58E02-GAL4在γ4/γ5多巴胺能神经元中表达FLP时，在蘑菇体中未观察到GFP信号。这些结果与之前发现一致，即Dpr12由Kenyon细胞表达而非其他蘑菇体投射神经元表达。

Brp和Dlg1在投射神经元中的稀疏标记

研究人员还验证了dFlpTag系统在稀疏神经元标记中的应用。使用pdf-GAL4靶向四个腹外侧神经元时，在条件型Brp dFlpTag-smGFp::HA品系中，HA标记的Brp点状信号特异性在突触前末梢检测到。使用投射神经元特异性split-GAL4（VT001606-AD; VT033008-DBD）时，DsRed特异性标记了一对神经元，其轴突和树突分别在大蘑菇体萼和一个触角叶 glomerulus 中分支。同时，HA标记的Brp或Dlg1点状信号在V glomerulus和萼中检测到，精确定位于DsRed标记的轴突和树突结构上。这些结果与连接组数据一致，表明这些投射神经元在glomerulus和萼中都有突触释放位点和接收突触输入。

研究结论与讨论

dFlpTag系统作为一种新型蛋白标记工具，成功实现了内源蛋白的组成型和条件型标记。与以往工具不同，dFlpTag盒式结构包含mtdTomato编码序列，仅在FLP介导的盒式翻转后由GAL4激活。当使用UAS-FLP时，mtdTomato在GAL4阳性细胞中表达，这些细胞可能表达也可能不表达目标蛋白。因此，通过使用靶向不同细胞类型的各种GAL4驱动器，可以基于标记蛋白的表达来识别源细胞。这一应用在蘑菇体中通过使用Kenyon细胞或多巴胺能神经元特异性GAL4驱动器标记Dpr12得到了证明。

FLP表达也可以通过GAL4非依赖性方法激活。研究人员测试了hs-FLP，它通过热激启动子在快速温度变化时表达。热激诱导随机盒式翻转和随后的稀疏蛋白标记。如翅盘中稀疏Dlg1标记和上皮标记所示，mtdTomato也在GAL4表达和盒式翻转的交集细胞中表达。这种稀疏标记至少有两个优势：首先，它有助于在单细胞水平阐明蛋白定位细节，对于介导细胞间相互作用的蛋白尤为重要；其次，当特定候选细胞类型的GAL4驱动器不可用时，可以使用表达谱更广的GAL4驱动器生成目标蛋白和单个细胞的随机共标记，有助于揭示源细胞的身份。

需要注意的是，GFSTF内部插入在72%情况下保持正常蛋白功能，意味着近30%的GFSTF插入可能存在功能异常。smGFP融合的影响尚未系统研究。虽然dFlpTag用GFSTF或smGFP标签成功标记了三种蛋白并揭示了它们的亚细胞定位，但smGFP标记的Dpr12在成虫脑中失去了区室特异性定位，暗示smGFP在某些条件下可能干扰蛋白功能。smGFP::HA（38.5 kDa）和GFSTF（33.5 kDa）的尺寸差异对于像Dpr12（37 kDa）这样的小蛋白可能在定位和功能上变得显著。

dFlpTag的应用取决于合适的编码内含子中MiMIC、CRIMIC和其他可重组交换盒式结构的存在。生物信息学分析表明，果蝇中约6000个基因含有适合蛋白标记的编码内含子，其中近2000个基因的编码内含子中已有MiMIC插入。一个正在进行中的项目旨在通过使用CRISPR/Cas9技术在数千个额外基因中生成MiMIC样盒式结构，预计将显著扩大dFlpTag系统的未来应用。

这项研究不仅提供了一种强大的新工具，还为理解复杂神经系统中蛋白表达和细胞功能的关系开辟了新途径。随着更多基因被标记，dFlpTag有望在果蝇遗传学研究中发挥重要作用，特别是在神经发育和疾病模型研究中。