小鼠脑中RNA修饰、选择性剪接与环状RNA全景：肌苷的核心作用及其超越

《Scientific Reports》：RNA modifications, alternative splicing and circular RNA landscape in the mouse brain: inosine and beyond

本研究针对RNA修饰如何调控大脑转录组复杂性这一关键问题，聚焦于富含在内含子区的肌苷（I），利用ADAR2单敲除（Adar2KO）及ADAR1/ADAR2双敲除（Adar1/2KO）小鼠模型，结合LC-MS/MS和高通量测序技术，揭示了ADAR酶扰动不仅影响选择性剪接（AS）和环状RNA（circRNA）表达谱，还引发其他RNA修饰（如m6Am、m6A）和DNA修饰（如m5dC）的全局性变化。该研究首次通过滚环逆转录纳米孔测序技术估算了circRNA中肌苷的丰度，为理解大脑中复杂的转录后调控网络提供了新视角，对揭示神经发育及疾病机制具有重要意义。

　　

大脑是人体最复杂的器官，其功能的正常运转依赖于高度精细的基因表达调控。在这个调控网络中，信使RNA（mRNA）并非简单的信息传递者，它本身会经历多种化学修饰，这些修饰如同给RNA字母戴上了“小帽子”或进行了“化妆”，极大地扩展了转录组的多样性和调控潜力，这一领域被称为“表观转录组学”（Epitranscriptomics）。在众多RNA修饰中，由ADAR（腺苷脱氨酶作用于RNA）酶催化腺苷（A）转变为肌苷（I）的A-to-I编辑，因其在大脑中尤为活跃且富集于内含子区域，而被认为在调控基因表达，特别是RNA剪接过程中扮演着关键角色。RNA剪接是将前体mRNA（pre-mRNA）中的内含子（非编码区）切除，并将外显子（编码区）连接起来的过程，而选择性剪接（Alternative Splicing, AS）则允许一个基因产生多种不同的蛋白质变体，这对于神经元的多样性和功能特异性至关重要。此外，另一种特殊的剪接形式——反向剪接（backsplicing），能够产生共价闭合的环状RNA（circular RNA, circRNA），这类RNA在脑中含量丰富，并参与多种重要的细胞功能。

尽管一些RNA修饰（如m⁶A）已被证明与剪接相关，但大脑中RNA修饰、选择性剪接和环状RNA生成三者之间的复杂相互作用仍是一个未被充分探索的广阔领域。特别是，肌苷如何全局性地影响大脑的转录组景观，尤其是其对选择性剪接和环状RNA生物发生的影响，尚缺乏系统性的研究。理解这些相互作用对于揭示神经系统发育、功能维持以及相关疾病（如神经退行性疾病、精神疾病）的分子机制具有至关重要的意义。

为了深入探索这一问题，由Magdalena J. Koziol领导的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们旨在系统性描绘小鼠大脑中与剪接相关的RNA修饰图谱，并重点探究肌苷在调控选择性剪接和环状RNA景观中的作用。研究人员巧妙地运用了多种前沿技术手段，包括液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行精确的RNA/DNA修饰定量分析，以及Illumina和牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology, ONT）等高通量测序平台。他们特别开发了一种基于滚环逆转录的ONT测序方法，用于可靠地鉴定完整的环状RNA分子并检测其中的潜在编辑位点。研究的关键在于利用了两种基因工程小鼠模型：ADAR2缺陷小鼠（Adar2KO）以及同时缺乏ADAR2和ADAR1催化活性的小鼠（Adar1/2KO），通过比较这些模型与野生型（WT）小鼠的大脑转录组，来揭示ADAR酶和肌苷编辑的生物学功能。所有实验均使用了来自特定小鼠品系的脑组织样本，并设置了生物学重复以确保结果的可靠性。

RNA修饰在脑核polyA RNA中的富集

研究人员首先致力于寻找那些可能参与剪接调控的RNA修饰。他们的策略是聚焦于富含内含子的前体mRNA，并鉴定在这些区域中富集的修饰。通过比较从野生型小鼠大脑中分离的核内polyA RNA（富含未剪接的前体mRNA）与总polyA RNA（代表更成熟的mRNA群体）的修饰组成，利用LC-MS/MS进行精确定量。结果发现，肌苷（I）和N6,2'-O-二甲基腺苷（m⁶Am）在核内polyA RNA中显著富集，提示这两种修饰可能与内含子区域和剪接过程密切相关。为了进一步验证，他们在原代大鼠神经元中使用剪接抑制剂Pladienolide B（PlaB）和新生RNA标记物4-硫尿苷（4SU）来特异性富集未剪接的mRNA，LC-MS/MS分析再次证实了肌苷、m⁶Am以及其他几种修饰（如m¹G, m⁶A）在未剪接转录本中的富集。这些筛选性数据将肌苷确立为后续深入研究的核心候选分子。

环状RNA中潜在肌苷修饰的丰度

鉴于环状RNA在大脑中的重要性，研究团队接下来探索了肌苷是否存在于以及如何存在于circRNA中。由于circRNA丰度低，直接使用LC-MS/MS检测其修饰面临挑战。因此，他们转向高通量测序方法。肌苷在逆转录过程中被读作鸟苷（G），因此在测序数据中表现为A-to-G的突变。为了准确鉴定circRNA，团队开发了一种创新的方法：先富集circRNA，然后利用滚环逆转录产生包含多个重复单元的长cDNA分子，再通过能够读取长片段的ONT平台进行测序。通过检测这些长读长序列中的非重复性延伸重复，可以可靠地识别完整的circRNA分子。应用此方法，他们在野生型小鼠大脑中鉴定出了数千个circRNA，其中包含大量先前未报道的新circRNA。更重要的是，他们首次在这些ONT确认的circRNA中发现了数千个潜在的A-to-I编辑位点，为circRNA可能存在转录后修饰提供了初步证据。

ADAR2缺失及ADAR1/ADAR2联合催化活性丧失对全局RNA和DNA修饰景观的影响

为了研究肌苷的功能，研究人员比较了野生型、Adar2KO和Adar1/2KO小鼠的大脑。LC-MS/MS分析显示，在总RNA水平，仅Adar1/2KO小鼠表现出肌苷含量的显著降低，而Adar2KO小鼠则无显著变化，这可能是由于大量肌苷存在于其他ADAR非依赖的RNA（如tRNA）中。出乎意料的是，ADAR酶的扰动引起了其他RNA修饰的广泛变化。在Adar2KO小鼠的长链RNA（>200 nt）中，m¹G、m⁵U和m⁶Am等修饰水平发生变化；而在Adar1/2KO小鼠中，短链RNA（<200 nt）的m⁶A水平下降。更令人惊讶的是，DNA修饰也受到影响，Adar1/2KO小鼠大脑中5-甲基-2'-脱氧胞苷（m⁵dC）水平降低，而5-羟甲基-2'-脱氧胞苷（hm⁵dC）水平在两种突变体中均升高。这些结果表明，ADAR酶的功能缺失会产生远超出A-to-I编辑本身的广泛分子效应，可能通过间接机制或全局性转录组重塑影响表观遗传景观。

深入探究前体mRNA中的肌苷特征

通过对新生RNA（富含内含子）进行高通量测序，研究人员在野生型小鼠大脑中精确鉴定了33,534个高置信度的A-to-I编辑位点。这些位点绝大多数（约90%）位于内含子区，强烈支持了肌苷在内含子中富集的结论。其中，65%的位点依赖于ADAR2，35%依赖于ADAR1。大多数编辑事件发生在低频率（编辑率<0.5），但也在一些与脑功能相关的基因（如Fgf14, KCNIP4）中发现了大量编辑位点。这些发现详细描绘了小鼠大脑中A-to-I编辑的精细图谱。

ADAR2缺失及ADAR1/ADAR2联合催化活性丧失影响与突触传递相关的转录本的选择性剪接

通过分析成熟mRNA的测序数据，研究人员发现Adar2KO和Adar1/2KO小鼠中存在大量显著差异的选择性剪接事件。在Adar2KO小鼠中，外显子跳跃（SE）是最常见的类型，而在Adar1/2KO小鼠中，互斥外显子（MXE）事件更为突出。特别值得注意的是，在含有肌苷的转录本中，内含子保留（RI）事件在Adar2KO背景下显著减少，而MXE事件在Adar1/2KO背景下普遍增加。基因本体论（GO）分析显示，发生差异剪接的基因富集于mRNA加工、翻译、突触组织、离子跨膜运输等与脑功能密切相关的通路。研究人员还通过RT-qPCR验证了特定基因（如Gria4, Traf6）的剪接变化，并通过颅内注射表达功能性或催化失活型ADAR2的腺相关病毒（AAV）进行挽救实验，证实了某些剪接变化的调节依赖于ADAR2的编辑活性。

ADAR酶影响环状RNA表达谱

结合Illumina（用于定量）和ONT（用于结构确认）测序，研究团队发现ADAR酶的扰动显著改变了大脑中的circRNA表达谱。在Adar2KO和Adar1/2KO小鼠中，分别有573和1,487个circRNA表达发生差异，其中大部分来源于含有肌苷编辑的前体mRNA。他们验证了几个有趣的circRNA案例：例如，源自Adar2基因本身的Adar2-circ在突变小鼠中表达显著上调；源自Fstl5基因（与听力损失相关）和Gabra2基因（编码GABA_A受体亚基）的circRNAs也发生显著变化。这些发现将ADAR编辑、circRNA生物发生与潜在的神经功能（如听觉、抑制性神经传递）联系起来。此外，通过分析转录延伸速度，他们排除了肌苷通过影响转录速度来间接调控circRNA的可能性。

研究结论与意义

本研究通过多组学整合分析，系统地揭示了小鼠大脑中RNA修饰（特别是肌苷）、选择性剪接和环状RNA景观之间复杂的相互作用网络。研究不仅确认了肌苷在内含子区的富集及其对选择性剪接的调控作用，还首次利用滚环纳米孔测序技术对circRNA中的肌苷进行了初步估算。最出人意料的发现是，ADAR酶的扰动引发了其他RNA修饰和DNA修饰的全局性变化，提示ADAR酶可能通过编辑依赖或编辑非依赖的方式，参与调控一个更广泛的表观遗传网络。

该研究的创新之处在于其综合性的研究策略和技术方法的创新（如circRNA鉴定）。研究结果强调了在理解与ADAR编辑失调相关的神经系统疾病（如情绪障碍、精神分裂症）时，除了关注编码区的编辑事件，内含子区编辑通过影响RNA加工（如剪接、环化）所导致的全局性转录组变化同样不容忽视。这些关联性发现为未来的机制研究奠定了坚实的基础，指明了需要深入探索的方向，例如：其他RNA修饰的变化是ADAR缺失的直接后果还是次级效应？特定的circRNA如何受肌苷调控并影响神经元功能？解答这些问题将极大地深化我们对大脑复杂调控网络的理解，并为相关疾病的诊断和治疗提供新的思路和靶点。