靶向CHK1与MUS81协同抑制：克服高危神经母细胞瘤复制应激抵抗的新策略

《Scientific Reports》：Synergistic inhibition of CHK1 and MUS81 to combat replication stress resistance in high-risk neuroblastoma

本研究针对高危神经母细胞瘤因17q增益导致的复制应激抵抗难题，通过整合生物信息学分析与功能实验，首次发现FANCJ是关键的17q剂量敏感依赖性基因。研究人员证实FANCJ完全敲除可抑制肿瘤生长并增强CHK1抑制剂敏感性，进而利用MUS81抑制剂Dyngo-4a/MUS81in1与Prexasertib联用，在体外模型中展现出显著协同抗肿瘤效应。该研究为克服高危神经母细胞瘤治疗耐药提供了新的联合靶向治疗策略。

　　

在儿童恶性肿瘤中，神经母细胞瘤（Neuroblastoma, NB）堪称一道棘手的医学难题。这种起源于未成熟交感神经母细胞的肿瘤，虽然总体突变负荷较低，却具有高度的临床异质性。尤其令人困扰的是高危病例，即使经过强化的多模式治疗，仍面临高复发率和不良预后。更棘手的是，由于缺乏高频突变靶点，针对特定分子病变的精准治疗策略难以实施。然而，科学家们注意到一个关键线索：高危神经母细胞瘤普遍存在反复出现的染色体失衡，其中MYCN癌基因扩增和17号染色体长臂（17q）增益尤为突出。17q增益在高危神经母细胞瘤中的发生率高达约80%，这强烈暗示该区域可能隐藏着驱动肿瘤恶性进展的“幕后推手”。那么，17q增益究竟通过何种机制促进神经母细胞瘤的发展？能否从中挖掘出新的治疗靶点，以破解当前的治疗困境？

为了回答这些问题，由Elien Hilgert、Christophe Van Neste等共同主导，Kaat Durinck教授作为通讯作者的研究团队在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们开展了一项整合DNA拷贝数变异、基因表达和患者风险分类数据的生物信息学分析，旨在从17q增益区域中筛选出关键的剂量敏感依赖性基因，并探索其作为治疗靶点的潜力。

研究人员为开展本研究，主要运用了以下几项关键技术：首先，他们对包含556例高危神经母细胞瘤患者的公开数据集（GSE85047）进行了整合生物信息学分析，建立了基因排名流程以筛选17q上的候选基因。其次，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建了FANCJ基因敲除的神经母细胞瘤细胞模型。再者，通过高通量药物筛选平台（如IncuCyteTM活细胞成像系统）评估了单药及联合用药（CHK1抑制剂Prexasertib、MUS81抑制剂Dyngo-4a和MUS81in1、WEE1抑制剂MK1775）对细胞增殖、凋亡（Caspase-GloTM 3/7检测）和细胞周期的影响，并采用Bliss独立性模型评价药物协同作用。此外，还运用批量RNA测序（RNA-seq）进行转录组分析（包括差异表达分析、基因集富集分析GSEA），并通过蛋白质印迹（Western blot）和定量免疫荧光显微镜技术检测DNA损伤（γH2AX）、复制应激（pCHK1S345）和凋亡（cleaved PARP）等相关蛋白表达水平。

17q剂量驱动的候选依赖性基因在神经母细胞瘤中富集于细胞周期控制、复制应激和DNA损伤反应相关基因

研究团队通过对219例原发性高危神经母细胞瘤样本的分析，建立了一套排名系统，综合评估了17q上每个基因的增益频率（渗透率）、拷贝数对表达的驱动作用（剂量敏感性）以及表达水平与患者风险分类的关联（风险关联）。结果显示，在MYCN扩增（MNa）和非扩增（MNna）的高危神经母细胞瘤中，排名前50的基因有35个是共有的，并且这些基因显著富集于DNA损伤修复、复制应激和细胞周期检查点调控等过程。其中，DNA解旋酶FANCJ（也称为BRIP1或BACH1）在两组中均位列第一。进一步分析表明，FANCJ在神经母细胞瘤中的表达高于其他癌症类型，并且在TH-MYCN驱动的鼠神经母细胞瘤发生过程中表达上调。重要的是，高FANCJ mRNA表达与患者较差的总生存期和无事件生存期显著相关，并且在携带17q增益的高危病例中表达升高。

FANCJ敲除的神经母细胞瘤细胞生长能力下降

为了验证FANCJ的功能，研究人员首先尝试了siRNA介导的瞬时敲低，但未观察到对细胞生长的显著影响。随后，他们利用CRISPR-Cas9技术在SK-N-BE(2)-C和SH-SY5Y细胞中成功构建了完全敲除（FANCJ-KO）和部分敲除（sgFANCJ）模型。结果发现，只有完全敲除FANCJ才会导致细胞增殖显著减少，并伴随p53通路激活（CDKN1A/p21上调）。在CHK1抑制剂Prexasertib处理下，完全敲除FANCJ的SK-N-BE(2)-C细胞和部分敲除FANCJ的SH-SY5Y细胞对Prexasertib的敏感性增加，而部分敲除FANCJ的SK-N-BE(2)-C细胞则与对照反应相似。这些数据表明，FANCJ的完全缺失会增强神经母细胞瘤细胞对ATR-CHK1信号通路的依赖性。

MUS81和CHK1联合抑制在神经母细胞瘤中发挥协同作用

鉴于目前缺乏特异性的FANCJ抑制剂，并且近期研究表明FANCJ在MUS81依赖的复制叉重启通路中起上游作用，研究团队将目光投向了MUS81这个潜在的药物靶点。他们使用了两种MUS81抑制剂：Dyngo-4a（最初作为发动蛋白抑制剂被发现，也能抑制MUS81-EME1/2相互作用）和MUS81in1（一种通过片段筛选发现的新型小分子抑制剂）。在多种神经母细胞瘤细胞系（IMR-32, NGP, CLB-GA）中，Dyngo-4a或MUS81in1与低剂量的Prexasertib（CHK1抑制剂）联合使用时，显示出强烈的协同作用（Bliss独立性评分BI > 0.2），显著降低细胞汇合度、诱导细胞凋亡和S期阻滞，而对非癌性的视网膜色素上皮（RPE）细胞影响甚微。同样，MUS81抑制剂Dyngo-4a与WEE1抑制剂MK1775联用也观察到协同效应。值得注意的是，在FANCJ敲除的神经母细胞瘤细胞中，MUS81与CHK1抑制的协同作用在更低浓度的Prexasertib下即可实现，提示FANCJ缺失增强了肿瘤对CHK1通路的依赖性和对复制应激靶向联合治疗的敏感性。

MUS81-CHK1轴联合药理抑制下调DNA损伤修复和复制应激抵抗相关基因特征

为了深入理解联合治疗的分子机制，研究人员对经Dyngo-4a单药（IC₅₀浓度）或Dyngo-4a/Prexasertib联合（低剂量）处理24小时的IMR-32细胞进行了转录组测序分析。主成分分析显示联合治疗引起了独特的转录变化。基因集富集分析表明，联合治疗显著下调了与MYC、E2F靶点、G2-M检查点、DNA复制、双链断裂修复、解旋酶和核酸酶活性相关的基因集，同时上调了p53通路和TNFα通过NFκβ的信号传导。而单用Dyngo-4a IC₅₀则主要影响线粒体能量代谢、氧化磷酸化以及未折叠蛋白反应等过程。蛋白质印迹实验进一步证实，联合处理增加了DNA损伤（γH2AX）、复制应激（pCHK1S345）和凋亡（cleaved PARP）的标志物水平，同时Prexasertib处理导致CHK1自身磷酸化（pCHK1S296）丢失。定量免疫荧光显微镜也检测到联合治疗后γH2AX焦点增加。

本研究通过整合生物信息学与功能实验，首次将FANCJ确立为高危神经母细胞瘤17q增益的关键剂量敏感依赖性基因。研究证实，完全敲除FANCJ可抑制肿瘤生长并增强对CHK1抑制的敏感性。更重要的是，研究团队创新性地提出并验证了靶向FANCJ下游效应分子MUS81，并将其与CHK1或WEE1抑制剂联用的治疗策略。两种不同的MUS81抑制剂（Dyngo-4a和MUS81in1）与Prexasertib的组合均在体外模型中展现出强大的协同抗肿瘤活性，且对正常细胞毒性较小。分子机制研究表明，该联合疗法通过扰乱细胞周期进程、抑制DNA复制与修复通路，最终导致复制应激加剧、DNA损伤累积和细胞凋亡。

这项研究的意义在于，它不仅揭示了17q增益影响神经母细胞瘤恶性表型的新机制，更重要的是为克服高危神经母细胞瘤的复制应激抵抗提供了极具潜力的联合治疗新靶点和新策略。鉴于MUS81抑制剂与CHK1/WEE1抑制剂联用展现出的良好协同效应和肿瘤选择性，该研究为后续开展临床前动物模型实验乃至未来临床试验奠定了坚实的理论基础，有望为改善高危神经母细胞瘤患儿的预后带来新的希望。