炎症与疼痛信号传导中保守的小RNA网络在小鼠和人类中的研究

《Translational Psychiatry》：Conserved small RNA networks link inflammation to pain signaling in mice and men

本研究针对炎症如何导致疼痛的机制尚不明确的问题，聚焦于小非编码RNA（sncRNA）在炎症性和慢性疼痛中的作用。研究人员通过脂多糖（LPS）诱导的小鼠炎症模型和纤维肌痛综合征（FMS）患者样本，鉴定出一组保守的microRNA（miR）和转运RNA片段（tRF）特征。这些疼痛相关sncRNA在炎症状态和人类伤害性感受器分化过程中呈现动态变化，并与胆碱能和疼痛相关长链RNA存在相互作用。研究揭示了sncRNA作为连接炎症与疼痛信号的保守调控分子，为疼痛生物标志物开发和靶向治疗提供了新思路。该成果发表于《Translational Psychiatry》。

　　

疼痛，作为人类体验中一个复杂而关键的方面，反映了感觉感知、情绪状态和生理反应之间错综复杂的相互作用。其中，炎症性疼痛可由组织损伤或感染直接引发，免疫系统的激活导致促炎介质（如细胞因子、趋化因子和前列腺素）的释放，这些介质会敏化伤害性感受器，导致痛觉过敏和异常性疼痛，成为炎症性疼痛的标志性特征。然而，与具有明显炎症标志物的经典炎症性疼痛不同，纤维肌痛综合征（FMS）等非炎症性疼痛条件通常缺乏活跃的免疫反应，其病理生理学被认为涉及中枢神经系统敏化。尽管存在差异，但FMS和炎症性疼痛综合征都表现出改变的伤害性感受器反应、涉及离子通道的通路以及对某些治疗（如抗抑郁药和抗惊厥药）的重叠反应，这表明它们背后可能存在着共享的分子机制。近年来，小非编码RNA（sncRNAs），特别是microRNAs（miRs）和转运RNA片段（tRFs），被发现在疼痛调节中扮演重要角色，它们能够通过启动mRNA降解、抑制翻译等多种机制调控基因表达。但是，这些sncRNAs是否以及如何作为分子桥梁连接炎症与疼痛信号，尤其是在不同物种、组织和疼痛模式中是否保守，仍然是一个亟待解答的问题。

为了回答上述问题，由Nimrod Madrer、Estelle R. Bennett、Shani Vaknine-Treidel、Menachem Hanani和Hermona Soreq（共同通讯作者）组成的研究团队开展了一项深入研究，其成果发表在《Translational Psychiatry》期刊上。研究人员旨在鉴定在急性和慢性疼痛设置下可能驱动炎症性疼痛的sncRNA特征，并探索其保守性和功能意义。

本研究主要运用了以下关键技术方法：研究人员使用了LPS诱导的小鼠炎症模型，并采集了小鼠的三叉神经节（感觉神经节）和颈上神经节（交感神经节）进行小RNA测序分析。同时，研究整合分析了多个公共数据集，包括来自FMS患者血液细胞和角质形成细胞的sncRNA数据、人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为伤害性感受器过程中的RNA测序数据、小鼠坐骨神经分支结扎（SNI）模型背根神经节（DRG）的RNA测序数据以及人类骨关节炎患者滑膜组织的sncRNA数据。通过生物信息学分析，包括差异表达分析、主成分分析（PCA）、表达相关性分析以及利用TarBase、miRNet、Rummagene等在线工具进行功能验证和关联分析，来揭示疼痛相关sncRNA的特征、保守性及其与疼痛相关通路的联系。部分测序结果还通过定量实时PCR（qRT-PCR）进行了验证。

研究结果

LPS暴露导致三叉神经节和颈上神经节中sncRNA水平的瞬时变化

为了模拟炎症性疼痛，研究人员给小鼠单次腹腔注射LPS，并在注射后4小时、24小时和7天收集其三叉神经节和颈上神经节进行小RNA测序。结果显示，LPS暴露后，两种神经节中的miR和tRF表达呈现出时间和空间特异性的动态变化模式。在三叉神经节中，注射后24小时内miR和tRF（尤其是来源于父本tRNA 5‘端的tRF）水平显著增加，但在一周后完全下降，并被两者水平的降低所取代。相反，在颈上神经节中，tRF水平出现即时但短暂的下降（从4小时开始，至24小时结束），而miR水平则呈现延迟（一周后）增加的反应。这种模式与之前的研究发现一致，即miR是长期刺激的典型反应者，而tRF是快速反应者。值得注意的是，一些在LPS暴露后发生变化的miR和tRF在不同时间点以及不同神经节类型之间存在重叠，表明反应模式存在一定程度的保守性。

LPS诱导的sncRNAs反映了FMS相关的变化

为了研究慢性非炎症性疼痛模型中的sncRNAs，研究人员将上述急性炎症模型中发生变化的sncRNAs与FMS患者角质形成细胞和有核血细胞中发生变化的sncRNAs进行了比较。结果发现，一些差异表达（DE）的tRF和miR在小鼠神经节和人类FMS患者样本中是共享的。这表明这些特定的sncRNAs可能与疼痛相关，而不受反应时间、物种或组织的影响，因此研究人员将其称为“疼痛相关sncRNAs”。这些疼痛相关sncRNAs包括miR-144-5p、miR-183-5p、miR-143-3p、miR-128-3p、miR-144-3p、miR-451a、miR-96-5p、miR-29b-3p、miR-1249-3p、miR-221-5p、miR-146a-5p、miR-155-5p、miR-122-5p以及多个特定tRF。重要的是，虽然基于所有表达的sncRNA的主成分分析（PCA）无法区分LPS暴露组和盐水对照组小鼠，但仅基于上述疼痛相关sncRNAs的PCA则能在一定程度上将两组分开，这表明这组少量的sncRNAs具有区分炎症状态和对照状态的潜力。

疼痛相关sncRNAs由两个负相关组群构成

接下来，研究人员评估了疼痛相关sncRNAs在LPS处理小鼠神经节中的表达模式，以确定它们是否呈现平行或相反的表达。通过表达水平相关性分析，发现这些sncRNAs聚集成了两个组群（Group A和Group B）。每个组群内部由表达模式相似（正相关）的miR和tRF组成，而两个组群之间则呈负相关，即一个组群sncRNA水平的增加伴随着另一个组群水平的降低。Group A中的sncRNAs在LPS暴露小鼠中普遍呈现下调（负的倍数变化），而Group B中的sncRNAs则普遍呈现上调（正的倍数变化）。研究人员计算了Group A与Group B sncRNA总丰度的比值，发现该比值在LPS暴露下于两种神经节中均降低，这可能反映了一种全神经节的疼痛相关反应。

疼痛相关sncRNAs与驱动伤害性信号的能力相关

为了探究疼痛相关sncRNAs是否在传递疼痛信号的感觉神经元中发挥作用，研究人员分析了一个人诱导多能干细胞（iPSCs）分化为伤害性感受器六个阶段的数据集。由于向伤害性感受器的分化过程包含了转导疼痛信号的特定细胞机制的发展，研究人员希望检验疼痛相关sncRNAs是否也在此分化过程中发生改变。结果显示，仅使用在该iPSCs数据集中表达的疼痛相关sncRNAs进行PCA分析，能够清晰地呈现出从iPSCs到完全分化的伤害性感受器的各个分化阶段的梯度变化。在该数据集中，疼痛相关sncRNAs之间的相关性模式与在LPS暴露的小鼠神经节中观察到的模式相似。此外，两个sncRNA组群（Group A/Group B）的比值随着分化阶段的推进而增加，在成熟的伤害性感受器中达到最高。这表明所鉴定的sncRNAs在细胞水平上维持着一种进化上保守的、一致的关系，并提示在不同哺乳动物物种中，炎症性疼痛和产生伤害性信号的能力可能受到涉及小RNA调控因子的相似细胞机制的调控。

疼痛相关sncRNAs与疼痛相关和胆碱能转录本相关

为了研究上述疼痛相关sncRNAs变化的细胞表现，研究人员挖掘了iPSCs分化数据集中的长链RNA测序数据。通过分析疼痛相关sncRNAs与长链转录本的共表达关系，并结合小鼠坐骨神经分支结扎（SNI）模型背根神经节（DRG）中差异表达的转录本，研究人员鉴定出了一组既在疼痛条件下差异表达，又与疼痛相关sncRNAs存在相关性的转录本。有趣的是，进一步的分析发现，属于Group A和Group B的sncRNAs分别与不同的SNI差异表达转录本亚集和胆碱能转录本亚集相关。胆碱能信号已知是疼痛反应的主要贡献者之一。这表明在相关性分析过程中发现的两个sncRNA簇反映了不同的胆碱能和疼痛相关转录本集合。

疼痛相关sncRNAs及其相关转录本与疼痛综合征相关联

研究人员随后利用TarBase、miRNet等数据库工具，验证了疼痛相关miRs与SNI差异表达转录本之间实验证实的相互作用，并发现这些miRs与多种疼痛状况（包括外周神经损伤）相关。对于疼痛相关tRFs，虽然现有的经过验证的相互作用数据库信息有限，但基于序列的预测提示了它们与某些疼痛相关靶标（如MET、PAPPA2）的潜在相互作用。此外，利用Rummagene数据库进行的荟萃分析表明，大多数与疼痛相关sncRNAs相关的SNI差异表达转录本与至少一种疼痛综合征相关，其中与外周神经损伤的关联最为显著。这些发现将疼痛相关sncRNAs定位为小鼠和人类多种组织中疼痛状况的重要枢纽，并表明其影响可能至少部分反映了它们与疼痛相关转录本的关联。

疼痛相关sncRNAs可区分骨关节炎患者滑膜组织中的高疼痛和低疼痛

最后，为了在额外的人类数据集上验证分析结果，研究人员分析了来自具有低或高疼痛水平的骨关节炎患者的滑膜样本。结果显示，在伤害性感受器中升高、在LPS处理小鼠神经节中降低的疼痛相关sncRNA比值（Group A/Group B），在高疼痛滑膜样本中也显著升高。此外，尽管基于所有表达sncRNAs的PCA无法区分低疼痛和高疼痛样本，但仅基于疼痛相关sncRNAs的PCA则能够实现部分分离。这一发现强化了这些sncRNAs在介导疼痛传递的细胞反应中确实扮演着重要角色的观点。

结论与讨论

本研究揭示了小非编码RNA，特别是miR和tRF，在介导炎症和疼痛中的重要作用。通过分析LPS诱导的小鼠炎症模型，研究人员在感觉和交感神经节中鉴定出了具有时间和空间特异性表达模式的sncRNAs，这些sncRNAs可能参与疼痛调节。更重要的是，研究发现这些炎症诱导的sncRNAs与FMS患者样本中的sncRNAs存在显著重叠，提示了一种连接炎症与慢性疼痛状况的进化保守机制。

研究发现，LPS注射后tRF水平的早期快速变化与miR水平的较长期变化形成对比，这与先前关于miR作为长期反应者和tRF作为急性变化快速调节者的发现一致。这种动态反应表明sncRNAs是炎症性疼痛的关键分子介质。PCA分析进一步支持了这些sncRNAs对疼痛机制的相关性。

研究不仅鉴定了保守的疼痛相关sncRNAs，还通过转录组相关性分析探索了其功能相关性。实验验证和数据库分析确认了疼痛相关sncRNAs的调控作用。它们与SNI神经损伤模型中疼痛相关mRNA转录本的相关性表明，这些sncRNAs在炎症内外背景下均对疼痛综合征有所贡献。对骨关节炎队列的分析表明，疼痛相关sncRNAs不仅与不同数据集中的炎症相关，还与疼痛强度相关，提示它们可以作为跨不同疼痛状况的可靠疼痛严重程度指标。

本研究的发现具有重要的转化意义。鉴定出一组保守的疼痛相关sncRNAs为开发生物标志物开辟了新途径，有望实现慢性疼痛综合征的更精确诊断和患者分层。此外，靶向特定的sncRNAs可能提供新的治疗策略，以调节疼痛反应，同时最大限度地减少传统镇痛药的副作用。

当然，研究也存在一些局限性，例如未直接评估LPS处理小鼠的疼痛样行为，LPS暴露模型不能完全模拟FMS等慢性疼痛综合征的复杂性，以及跨物种、组织比较可能存在的技术差异等。未来需要在更大规模的人类患者队列中，利用微创程序可获取的组织进行更多研究，以牢固确立疼痛相关sncRNAs作为有用的生物标志物，并进一步阐明这些sncRNAs调控疼痛的机制通路，探索其临床转化的潜力。

总之，该研究结果强调了sncRNAs在连接炎症与疼痛中的关键作用，并为其参与急性和慢性疼痛状况提供了令人信服的证据。通过鉴定保守的疼痛相关miR和tRF，该研究有望推动对疼痛病理生理学的理解，并为新的诊断和治疗方法铺平道路。