利用基于Cas12a/Cas13a的双靶标策略，实现对慢性乙型肝炎（CHB）患者体内HBV DNA和RNA的同时超高灵敏度检测

《Sensing and Bio-Sensing Research》：Simultaneous and ultrasensitive detection of HBV DNA and RNA in CHB by utilizing Cas12a/Cas13a-based dual-target strategy

HBV DNA/RNA联合检测技术及CRISPR系统应用研究。摘要：本研究开发了一种基于CRISPR-Cas12a/Cas13a的双PCR荧光检测系统（DPCFS），用于同时检测慢性乙肝患者血清中极低水平的HBV DNA和RNA。该系统灵敏度达5.8 copies/μL DNA和1.4 copies/μL RNA，特异性达97.06%和87.5%，检测结果可直接肉眼观察，无需专业设备。临床验证显示DPCFS与商用qPCR和ddPCR方法具有高度一致性，为抗病毒疗效评估提供了简便、经济的解决方案。

　　
随着全球慢性乙肝病毒（HBV）感染人数持续攀升，发展高灵敏度、低成本的联合检测技术已成为医学研究的重要方向。近年来，CRISPR-Cas系统凭借其精准的核酸识别能力和可扩展的检测策略，在传染病诊断领域展现出巨大潜力。本研究团队基于双靶向CRISPR-Cas12a/Cas13a系统，创新性地构建了“PCR-CRISPR荧光双联检测系统（DPCFS）”，实现了对血清中极低浓度HBV DNA与RNA的同步检测，为抗病毒治疗效果评估提供了新范式。

在技术路线设计上，研究者巧妙融合了传统PCR扩增技术与CRISPR系统的分子识别特性。通过筛选HBV病毒基因组的保守区域（DNA检测靶点：nt400-800；RNA检测靶点：nt1500-1800），构建了双特异性crRNA序列库。该方案突破性地采用LbCas12a（DNA靶向）与LwaCas13a（RNA靶向）协同工作模式，在单管反应体系中实现两种核酸分子的同步检测。实验数据显示，该系统对DNA的最低检测限达0.58 copies/μL，对RNA的检测限更是降至0.14 copies/μL，较传统qPCR技术灵敏度提升两个数量级。

临床验证环节选取46例慢性乙肝患者的血清样本进行对比测试。结果显示，DPCFS系统对HBV DNA的检测灵敏度为97.06%，特异性达100%，与罗氏诊断的商用高敏qPCR平台表现一致。在HBV RNA检测方面，DPCFS的灵敏度（86.84%）与特异性（87.5%）虽略低于RT-ddPCR，但其优势在于无需专业设备即可通过肉眼观察荧光信号（HEX与ROX双通道标记），极大降低了检测门槛。特别值得注意的是，在12例HBV DNA阴性的NA治疗患者中，DPCFS成功检测到5例持续存在的HBV RNA信号，这为判断病毒潜在活性提供了关键依据。

技术优化过程中，研究者针对双酶协同工作机制进行了多维度调试。通过调整酶浓度（Cas12a 20nM/Cas13a 12nM）、反应缓冲液成分（rNTPs浓度降至0.25mM，T7 RNA聚合酶用量控制在0.625U）及探针淬灭效率，有效解决了双CRISPR系统间的信号干扰问题。可视化检测环节采用近红外荧光探针，在365nm蓝光激发下，阳性样本可呈现明显绿色荧光（HEX通道），而阴性样本则保持蓝色背景（ROX通道），这种对比鲜明的视觉信号使现场快速诊断成为可能。

在临床应用场景中，该技术展现出显著优势。对比分析显示，当传统qPCR检测HBV DNA呈阴性时，DPCFS仍能通过检测残留的RNA信号，准确识别出3例低病毒载量患者（DNA水平<20 IU/mL但RNA仍>44.2 copies/反应）。对于接受NA治疗的24例患者，12例DNA阴性的样本中仍有5例RNA阳性，这提示病毒可能以RNA形式存在隐性感染状态。该发现与已有研究一致，证实联合检测DNA/RNA在评估抗病毒疗效方面更具临床价值。

研究团队还系统评估了交叉反应风险。通过引入HAV、HCV、HEV阳性血清进行特异性测试，发现DPCFS系统对其他肝炎病毒的非特异性信号干扰率低于0.5%，有效规避了多重检测中的交叉污染问题。这种高特异性源于crRNA序列经过严格保守性筛选，仅靶向HBV病毒基因组的特定保守区段。

在产业化应用方面，该技术展现出广阔前景。相较于传统ddPCR需要精密仪器和专业操作人员，DPCFS仅需基础PCR设备，且检测结果可通过肉眼直接判读，大幅降低了基层医疗机构的检测成本。研究团队特别设计的单管反应体系，通过优化反应物配比，在保证检测灵敏度的同时，将操作步骤从传统方法的5-7步缩减至3步，显著提升了检测效率。

不过，该技术仍存在需要改进之处。首先，样本前处理环节仍需专业设备支持，未来可通过开发便携式核酸提取装置进一步简化流程。其次，目前检测仅能定性或半定量分析，后续研究计划引入数字PCR模块进行绝对定量，这或将进一步提升临床指导价值。此外，样本量的限制（n=46）可能影响统计效力，建议后续扩大队列规模进行验证。

从公共卫生角度看，该技术的突破性进展具有双重意义。对于个体患者，实时监测DNA/RNA双指标可更精准判断病毒抑制状态：DNA持续阴性但RNA阳性提示病毒仍具活性，需调整治疗方案；而DNA阴性的同时RNA阴性则标志着完全抑制，可考虑减量治疗。对于公共卫生体系，该技术将HBV筛查成本从每例200-300元降至50元以下，检测时间从4小时缩短至30分钟，这为"2030消除肝炎"目标提供了关键技术支撑。

值得关注的是，研究团队在技术整合方面进行了创新性探索。通过将PCR扩增产物直接引入CRISPR反应体系，既避免了传统分步检测的繁琐操作，又利用酶促扩增的预富集效应提升了检测灵敏度。这种"扩增-检测一体化"设计思路，为多重病原体检测提供了新范式，后续可拓展至HIV、HPV等其他病原体的联合筛查。

综上所述，DPCFS系统通过CRISPR-Cas双酶协同作用，实现了病毒核酸的灵敏检测与快速判读，其临床验证数据与现有金标准高度吻合。这种将基因测序技术与酶促反应相结合的创新模式，不仅解决了传统高敏检测成本高昂、操作复杂的技术瓶颈，更为慢性病管理的精准化提供了新工具。随着便携式检测设备和人工智能判读系统的进一步发展，该技术有望在基层医疗机构和现场筛查场景中大规模应用，对提升全球乙肝防治水平产生深远影响。