人朊病毒C端结构域独立形成毒性寡聚体的结构基础与神经毒性机制

《Communications Biology》：Structural and cellular properties of human prion protein oligomers

本研究针对朊病毒蛋白（PrP）错误折叠机制中的关键科学问题，通过聚焦其C端结构域（hPrPC125-230），首次发现该结构域在特定温度条件下可独立于N端易聚集区域（106-126）自发形成β-折叠富集的毒性寡聚体。研究人员通过多维核磁共振、冷冻电镜等生物物理技术解析寡聚体结构特征，并结合人源神经前体细胞模型证实其诱导线粒体碎片化和膜电位崩溃的神经毒性。该研究为朊病毒病中寡聚体驱动的毒性通路提供了新机制视角，对靶向C端结构域的抗神经退行性疾病策略具有重要启示。

　　

在神经退行性疾病研究领域，朊病毒病始终笼罩着神秘面纱。这类被称为传染性海绵状脑病（TSEs）的致命疾病，包括人类克雅氏病（CJD）和疯牛病（BSE），与朊病毒蛋白（PrP）从正常细胞型（PrP^C）向致病型（PrP^Sc）的转变密切相关。尽管已知PrP^Sc会形成不溶性的淀粉样纤维沉积于大脑，但越来越多的证据表明，真正扮演“神经杀手”角色的可能是那些难以捕捉的瞬态中间体——可溶性寡聚体。这些寡聚体如同隐形的毒素，在纤维形成前就已对神经元造成致命打击，然而由于其结构异质性和不稳定性，科学家对其形成机制和毒性原理的认识仍存在巨大空白。

长期以来，PrP的N端区域（尤其是106-126片段）被视为驱动蛋白错误折叠的“罪魁祸首”。但意大利那不勒斯费德里科二世大学Alfonso De Simone团队在《Communications Biology》发表的最新研究，彻底颠覆了这一传统认知。研究人员将目光投向PrP的C端结构域（hPrP^C_125-230），这个由三个α螺旋和一个短β链构成的球状区域，竟在特定条件下独立完成了从“乖学生”到“破坏者”的蜕变。

研究团队首先通过圆二色谱（CD）和核磁共振（NMR）谱学分析，巧妙发现野生型hPrP^C_125-230在63°C时呈现与致病突变体T183A在37°C时相似的结构不稳定性。尤其引人注目的是，¹H-¹⁵N异核单量子相干谱（HSQC）显示C端螺旋H3区域发生部分解折叠，同时出现β-结构增加，暗示该区域可能成为聚集的“热点”。

当在63°C下诱导聚集时，野生型蛋白在24小时内迅速形成硫黄素T（ThT）荧光阳性的寡聚体。透射电镜（TEM）图像清晰显示，这些寡聚体呈直径27±4纳米的球状结构，与T183A突变体形成的典型纤维形态截然不同。动态光散射（DLS）证实其在溶液中均一分布，流体动力学半径约100纳米。

更深入的结构分析揭示，傅里叶变换红外光谱（FT-IR）在1645 cm^-1处出现β-折叠特征吸收峰，但缺乏反平行β-折叠典型的1685 cm^-1信号。圆二色谱在217纳米处的负峰进一步佐证了β-折叠主导的构象。尤为关键的是，疏水性探针ANS荧光实验显示寡聚体表面疏水性显著增强，这可能是其穿透细胞膜的关键。

细胞实验结果更令人震撼。当用不同浓度寡聚体处理人源诱导多能干细胞分化的神经前体细胞（NPCs）时，线粒体网络出现剂量依赖性崩溃：0.3μM浓度下已观察到碎片化，1μM时形成独特的“气泡状”结构。图像分析显示线粒体面积、周长和分支长度均显著缩减，而圆形度增加，表明正常管状网络彻底瓦解。功能实验进一步证实，MitoTracker Red CMXRos荧光强度随寡聚体浓度增加而降低，提示线粒体膜电位（ΔΨm）崩溃。最终，3μM寡聚体处理导致细胞活性下降约40%，而单体处理无显著影响。

关键技术方法概览

本研究核心实验体系包含：①蛋白表达与纯化（原核系统表达hPrP^C_125-230，通过镍柱亲和色谱与分子排阻色谱纯化）；②结构解析技术（圆二色谱、多维核磁共振、傅里叶变换红外光谱）；③聚集表征方法（硫黄素T荧光动力学、透射电镜、动态光散射）；④细胞模型（人诱导多能干细胞分化的神经前体细胞）；⑤功能检测（线粒体形态成像、膜电位探针、阿尔玛蓝活性检测）。

热稳定性与构象特征

通过比较野生型与T183A突变体的热变性曲线，发现野生型在63°C时呈现与突变体37°C时相当的局部解折叠状态，其中螺旋H3的β-化倾向最为显著。

自组装与寡聚体结构

野生型蛋白在63°C下主要形成球状寡聚体而非纤维，其具有均一的流体动力学直径（约100纳米）、富β-折叠二级结构和增强的表面疏水性。

细胞毒性机制

寡聚体可被神经前体细胞内化，诱导线粒体网络碎片化、膜电位崩解和细胞死亡，且该效应具有剂量依赖性，而单体处理无显著影响。

该研究突破性揭示了PrP的C端结构域独立形成毒性寡聚体的能力，颠覆了“N端驱动聚集”的传统范式。尤其重要的是，研究证实这些寡聚体可通过破坏线粒体动力学直接引发神经毒性，为理解朊病毒病中早期神经元损伤提供了新模型。鉴于多数TSE相关突变集中于C端结构域，该发现提示稳定该区域构象可能成为新型治疗策略。这项研究不仅填补了PrP错误折叠路径中关键中间体的认知空白，更为针对寡聚体毒性的干预方案开辟了新的靶点空间。