不同结构家族Aca蛋白调控抗CRISPR操纵子的分子机制

《Communications Biology》：Regulation of anti-CRISPR operons by structurally distinct families of Aca proteins

本研究揭示了Aca7和Aca11两种不同家族抗CRISPR相关蛋白通过形成对称二聚体识别特异性反向重复序列来调控acr基因转录的分子机制。研究人员通过晶体结构解析、SEC-MALS和EMSA等技术，发现尽管Aca蛋白单体结构相似，但其二聚体功能单元的结构差异使其能够结合不同启动子，精细调控多种Acr蛋白的表达，为理解噬菌体克服CRISPR-Cas免疫的调控策略提供了新见解。

　　

在细菌与噬菌体之间永无休日的进化军备竞赛中，CRISPR-Cas系统作为细菌的适应性免疫防御机制，能够识别并切割入侵的噬菌体核酸。而噬菌体也演化出相应的对抗策略——产生抗CRISPR(Anti-CRISPR, Acr)蛋白。这些Acr蛋白通常与抗CRISPR相关(Anti-CRISPR-associated, Aca)蛋白在同一操纵子中共编码，形成精密的调控网络。然而，不同类型的Aca蛋白如何特异性识别其靶标启动子，以及它们在分子水平上的作用机制尚不完全清楚。

发表在《Communications Biology》上的这项研究，由韩国中央大学、新西兰奥塔哥大学和韩国极地研究所的研究团队共同完成，通过结构生物学和生物化学方法，系统阐明了Aca7和Aca11两种不同家族Aca蛋白的DNA结合机制，揭示了它们如何通过形成二聚体识别特异性反向重复(Inverted Repeat, IR)序列来调控抗CRISPR操纵子的转录。

研究人员主要运用了蛋白质结晶和X射线晶体学确定三维结构、尺寸排阻色谱-多角度激光光散射(SEC-MALS)分析寡聚状态、电泳迁移率变动分析(EMSA)验证DNA结合特性、位点定向突变验证关键残基功能、β-半乳糖苷酶报告基因 assay评估体内调控活性等技术方法。

Aca7的晶体结构与DNA结合特性

研究人员首先解析了来源于Halomonas caseinilytica的Aca7蛋白的晶体结构，分辨率达到1.25埃。结构显示Aca7形成由五个α-螺旋组成的螺旋束折叠，其中α2和α3构成典型的螺旋-转角-螺旋(Helix-Turn-Helix, HTH) motif。

SEC-MALS分析证实Aca7在溶液中以二聚体形式存在，分子量为18.93 kDa。晶体堆积分析发现MolA/SymA二聚体是最可能的生物学相关组装，其界面埋藏面积为828.6 ?2，涉及20个残基。关键残基R5、E29和E32参与形成氢键和盐桥，对二聚体稳定性至关重要。

启动子分析发现，在acrIF11-aca7操纵子的上游区域存在三个潜在的反向重复序列(IR1、IR2和IR3)。EMSA实验表明Aca7特异性结合包含19-bp IR2序列的DNA片段，该序列重叠于启动子的-35和-10元件。突变实验证实IR2是Aca7结合的必要条件，而IR1和IR3则非必需。

Aca11的独特结构与双重调控功能

对来源于Streptococcus prophage的Aca11研究表明，该蛋白在溶液中同样形成二聚体，分子量为18.63 kDa。Aca11的结构包含一个短的N末端β-片层和四个α-螺旋(α₁-α₄)，其中α₂和α₃形成HTH motif。

有趣的是，Aca11能够识别两个不同操纵子的启动子区域：其自身所在的acrIIA25.1-aca11操纵子以及邻近的acrIIA3-AP2操纵子。两个启动子区域共享高度相似的序列，均包含22-bp的反向重复序列。EMSA实验证实Aca11与这两个IR序列均能发生特异性结合，表明Aca11可能通过双重调控来协调不同Acr蛋白的表达。

DNA识别机制的实验验证

通过定点突变和功能分析，研究人员确定了Aca7和Aca11中参与DNA识别的关键残基。对于Aca7，位于α3螺旋的R38、Y40、K46和K49残基被证实直接与DNA相互作用。而对于Aca11，Y18、K22、Q28、S32、K38和R39等残基在DNA结合中发挥关键作用。

β-半乳糖苷酶报告基因实验进一步验证了这些关键残基在体内的重要性。二聚化破坏突变体(V3W、T5W和L44W)和DNA结合突变体在体内外实验中均表现出调控功能受损，证实了二聚化和特异性DNA识别对Aca蛋白转录抑制功能的必要性。

Aca家族蛋白的结构比较与进化意义

研究人员比较了目前已解析结构的五种Aca蛋白(Aca1、Aca2、Aca7、Aca10和Aca11)，发现尽管它们的序列一致性较低，但单体结构均呈现高度保守的α-螺旋束架构，均含有保守的HTH motif。

然而，在二聚体功能单元水平上，这些Aca蛋白表现出显著的结构差异。例如，Aca11的二聚体中识别螺旋间距较宽，可能适应其较大的IR序列靶标。这种结构多样性可能使不同Aca蛋白能够适应各自特定的调控功能和靶标DNA序列。

另一个重要发现是，所有Aca蛋白在结合DNA时均能诱导DNA弯曲或结合预弯曲的DNA。这种DNA弯曲现象可能是Aca家族成员有效结合其启动子的必要条件。

本研究系统阐明了Aca7和Aca11通过形成二聚体识别特异性IR序列来调控抗CRISPR操纵子转录的分子机制。尽管Aca蛋白在单体水平上结构相似，但其二聚体功能单元的构象多样性使它们能够识别不同的启动子序列，实现对多种Acr蛋白表达的精细调控。这些发现不仅深化了对细菌-噬菌体相互作用分子机制的理解，也为开发基于CRISPR-Cas系统的精准调控工具提供了新思路。