巨噬细胞内的骨桥蛋白通过诱导泡沫细胞的形成并释放促炎细胞因子，促进了颈动脉斑块的形成

《Stroke: Vascular and Interventional Neurology》：Intracellular Osteopontin of Macrophages Promotes Carotid Plaques Formation by Inducing Foam Cells and Releasing Proinflammatory Cytokines

细胞间通讯和机器学习分析揭示了SPP1高表达巨噬细胞在动脉粥样硬化性颈动脉斑块形成中的关键作用。体外实验证实，缺氧和氧化低密度脂蛋白刺激下，巨噬细胞内OPN升高通过细胞骨架重组促进泡沫细胞形成，并激活NF-κB通路释放炎症因子。临床数据验证了OPN在斑块进展中的重要性。

　　
动脉粥样硬化性颈动脉斑块的形成机制研究

背景与意义
动脉粥样硬化作为心脑血管疾病的主要病理基础，其斑块形成机制尚未完全阐明。颈动脉斑块作为重要的病理实体，其破裂可能导致急性脑卒中。近年来单细胞测序技术的发展为揭示斑块微环境中的细胞互作提供了新视角。该研究通过整合单细胞转录组学、体外功能实验和临床数据，系统揭示了SPP1基因编码的骨桥蛋白在斑块形成中的关键作用，特别是其胞内形式（iOPN）通过重塑细胞骨架和激活炎症通路的新型机制。

细胞亚群特征解析
基于单细胞RNA测序技术，研究团队在6例颈动脉斑块患者样本中鉴定出8种主要细胞类型，其中巨噬细胞亚群呈现显著分化特征。通过机器学习分析（包括LASSO回归和XGBoost算法）筛选出82个共有的关键基因，构建蛋白-蛋白互作网络，发现SPP1基因在斑块形成中具有核心地位。特别值得注意的是，SPP1高表达巨噬细胞（SPP1hi）亚群在斑块组织中的比例显著高于邻近正常动脉组织（p<0.05），且其功能特征覆盖脂质代谢、氧化应激响应和细胞骨架重塑等多个生物学过程。

iOPN调控泡沫细胞形成的分子机制
体外实验证实，当巨噬细胞暴露于1%氧张力（模拟斑块微环境）和氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）时，胞内OPN水平显著升高（3倍于常氧条件，p<0.001）。这种胞内OPN的积累通过双重机制促进泡沫细胞形成：一方面直接调控细胞骨架重组，使CD36和SR-A等脂质摄取受体在膜表面形成环状富集区；另一方面通过分泌IL-6、TNF-α和CCL2等炎症因子，激活血管平滑肌细胞（VSMCs）的增殖信号通路（MMP9表达增加2.8倍，α-SMA表达降低40%）。实验还发现，敲低SPP1基因可有效抑制上述效应，其作用机制与磷酸化MLC（myosin light chain）和RhoA信号通路的调控密切相关。

临床验证与转化价值
基于公共数据库的Mendelian随机化分析显示，SPP1基因表达水平与脑卒中风险呈显著正相关（OR=1.076，95%CI 1.009-1.148）。病理学分析进一步证实，在早期斑块（4例）与进展期斑块（5例）之间，OPN免疫染色强度存在剂量依赖性差异（p=0.032），且与斑块纤维帽厚度呈负相关（r=-0.47）。这些发现提示，靶向SPP1基因表达或其下游信号通路可能成为干预动脉粥样硬化的有效策略。

研究创新点
1. 首次建立"分泌OPN-胞内OPN"双信号调控模型，阐明分泌型OPN通过激活NF-κB通路间接调控VSMCs，而胞内OPN则通过骨架重组直接促进泡沫细胞形成的协同机制。
2. 突破传统M1/M2巨噬细胞分类范式，发现SPP1hi巨噬细胞亚群具有双重表型特征：既表达CD36、SR-A等脂质代谢相关基因，又同时分泌IL-1β、TNF-α等促炎因子，这种表型特征与斑块的不稳定性（如纤维帽薄化、脂质核心扩大）显著相关（r=0.62）。
3. 开发新型实验模型：通过构建含1%氧和50μg/mL ox-LDL的共培养体系，成功模拟斑块处的微环境应力，该模型使泡沫细胞形成效率提升至78%（对照组为12%）。

技术方法优化
研究采用多组学整合分析策略，包括：
- 单细胞测序（scRNA-seq）处理：通过Seurat平台进行数据标准化（R语言4.1.2版本），采用Harmony算法消除批次效应（PC1-PC5贡献率>85%）
- 功能注释分析：使用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，发现heme metabolism（p=0.001）和cytoskeleton organization（p=0.003）为显著功能模块
- 动物模型验证：J774.1巨噬细胞系与C57BL/6小鼠VSMCs共培养实验显示，SPP1siRNA处理可使MMP9分泌量降低62%（p<0.01）

关键发现总结
1. 细胞群体特征：斑块组织巨噬细胞亚群分化程度较正常组织提高2.3倍（FDR<0.05），其中SPP1hi亚群占比达47.3%（±3.8%）
2. 代谢重编程机制：通过油红O染色和流式细胞术检测到，iOPN激活状态下CD36/SR-A表达量分别达到对照组的3.2倍和2.8倍（p<0.001）
3. 炎症信号通路：Western blot显示磷酸化NF-κB p65在SPP1hi巨噬细胞中表达量达对照组的4.7倍（p<0.0001），且与OPN胞内定位呈正相关（r=0.89）
4. 治疗靶点验证：OPN中和抗体（2μg/mL）处理可使泡沫细胞形成效率降低至正常水平的35%（p<0.01），且显著抑制VSMCs的Ki67阳性表达（p=0.004）

临床转化潜力
研究团队通过开发"OPN信号抑制联合低氧应激干预"疗法，在小鼠颈动脉模型中观察到斑块体积缩小41%（p<0.001），纤维帽厚度增加28%（p=0.003）。值得注意的是，该疗法对已形成的斑块具有逆转作用，可使斑块脂质含量降低53%（油红O染色定量分析）。

未来研究方向
1. 胞内OPN的作用机制：计划采用冷冻电镜技术解析OPN与肌球蛋白II的复合物结构
2. 跨物种验证：拟构建ApoE-/- SPP1-/-双敲除小鼠模型，评估其动脉斑块形成差异
3. 递送系统开发：研究脂质纳米颗粒（LNP）介导的iOPNsiRNA递送效率（初步实验显示递送效率达82%）
4. 生物标志物探索：通过多重反应免疫分析（LC-MS/MS）检测血清iOPN水平与斑块稳定性的相关性（目前检测灵敏度已达0.1ng/mL）

该研究为动脉粥样硬化防治提供了新的理论依据和技术路径，特别是发现iOPN通过调控细胞骨架重组促进泡沫细胞形成的机制，打破了传统认知中分泌型OPN的单向作用模式，为开发靶向治疗药物（如小分子骨架重组抑制剂）开辟了新方向。