在三维生物打印的神经母细胞瘤模型中，研究基因修饰以增强L1CAM-CAR T细胞在实体肿瘤中的迁移能力

《Frontiers in Immunology》：Investigating genetic modifications to enhance L1CAM-CAR T cell migration in solid tumors in a 3D bioprinted neuroblastoma model

有效CAR T细胞浸润实体瘤仍是治疗成功的关键障碍。本研究通过3D生物打印神经母细胞瘤模型，结合单细胞RNA测序和CRISPR/Cas9技术，发现肿瘤浸润性CAR T细胞中SELPLG表达降低而SH2D2A表达升高，但体外迁移实验显示敲除SELPLG或过表达SH2D2A并未显著改善迁移能力，且在免疫缺陷小鼠模型中未增强抗肿瘤疗效。研究揭示了动物模型与人类生物学差异对CAR T细胞迁移机制研究的限制，强调需开发更符合人类肿瘤微环境的三维模型以优化CAR T细胞疗法。

　　
近年来，CAR T细胞疗法在血液系统肿瘤治疗中取得显著进展，但在实体瘤中的疗效仍面临重大挑战。神经母细胞瘤作为儿童常见实体瘤，其治疗尚未达到理想水平。本研究通过建立三维生物打印神经母细胞瘤模型，系统评估了CAR T细胞浸润能力与基因表达特征，为优化实体瘤免疫治疗提供了新视角。

研究团队首先构建了三维神经母细胞瘤模型，该模型采用立体光刻技术将SK-N-BE细胞整合于明胶基质中，成功模拟实体瘤的物理屏障和微环境特征。通过比较CD28和4-1BB共刺激CAR T细胞（靶向L1CAM）的浸润效率，发现CD28共刺激组T细胞浸润量是4-1BB组的近两倍（196,839 vs 104,381个细胞/模型）。值得注意的是，未转导的对照组T细胞虽能少量浸润（22,334个细胞/模型），但其比例仅为CAR组的10%-25%，这表明CAR结构本身可能通过增强T细胞受体激活来促进迁移。

单细胞RNA测序揭示了浸润T细胞的关键分子特征：SH2D2A（T细胞特异性适配蛋白）显著上调2.24倍（p=1.09e-192），而SELPLG（选择素P配体）下调2.19倍（p=5.92e-229）。值得注意的是，在跨内皮迁移实验中，虽然SH2D2A过表达组T细胞在2小时即达到50%迁移率（较对照组快24分钟），但实际迁移速度差异未达统计学显著性（p>0.05）。这种矛盾现象提示可能存在其他调控机制。

关于SELPLG的功能验证，研究团队通过CRISPR/Cas9技术成功敲除该基因，发现其敲除版本在体外迁移实验中显著提升跨内皮迁移效率（提前1小时达到50%迁移率）。但动物实验显示，在NOG免疫缺陷小鼠模型中，SELPLG敲除组并未显示出更优的肿瘤浸润或抗肿瘤效果。这一发现揭示了动物模型与人类在SELPLG功能上的差异：人类SELPLG与小鼠同源蛋白的氨基酸序列相似度仅为46%，可能影响实验结果的外推性。

机制分析表明，SH2D2A主要参与T细胞激活信号传导。研究显示，SH2D2A过表达组在CD3/CD28刺激后呈现更强的T细胞受体激活信号（如ITK磷酸化水平提升），同时伴随PD-1等抑制性受体表达增加。这种双重作用可能解释了为何SH2D2A过表达未显著提升迁移能力——虽然激活了迁移相关信号通路（如ITK-actin polymerization），但过度激活导致T细胞提前耗竭。

SELPLG的功能呈现复杂性：一方面作为选择素P（PSGL-1）的配体，促进T细胞与内皮细胞的黏附；另一方面可能通过抑制性信号通路限制迁移。研究团队发现，在体外实验中SELPLG动态表达——随着迁移过程表面表达量下降3倍（从初始的58.7%降至19.2%）。这种表型变化提示SELPLG可能通过正反馈调节机制促进细胞黏附，进而形成迁移的"刹车"效应。

实验创新性体现在构建了首个可区分T细胞浸润能力的3D生物打印模型。该模型通过24小时共培养后分离肿瘤内/外T细胞，结合单细胞测序（8964细胞）和 bulk测序（6组实验），成功识别出5个关键基因（SH2D2A、SELPLG、TIAM2、CORO1B、MYH10）。其中SH2D2A与CXCL12/CXCR4轴相关，而CORO1B可能通过调节整合素表达影响黏附。

临床转化方面，研究揭示了生物打印模型与小鼠模型的局限性：NOG小鼠缺乏人类肿瘤微环境的免疫抑制特征，且SELPLG基因敲除小鼠的肿瘤浸润T细胞数量较人类样本高40%-60%。此外，实验发现CAR T细胞在迁移过程中会动态调整SELPLG表达——早期高表达促进黏附，后期低表达促进脱离。这种动态平衡可能解释为何单纯敲除SELPLG未能提升体内疗效。

未来研究方向包括：1）开发整合血管内皮细胞、免疫细胞和基质细胞的三维模型；2）建立动态监测T细胞浸润过程的单细胞追踪系统；3）深入解析SH2D2A在T细胞受体激活与迁移之间的平衡机制。值得注意的是，研究团队已通过立体光刻技术构建了含微血管结构的3D模型（图6），这为后续研究提供了技术基础。

该研究的重要启示在于：CAR T细胞迁移是多重信号协同作用的结果。SH2D2A主要影响T细胞激活而非迁移本身，而SELPLG的调控作用可能存在组织特异性。此外，实验验证了生物打印模型在筛选迁移相关基因（如SELPLG）方面的有效性，但需结合人类类器官模型进行功能验证。这些发现为优化CAR T细胞工程提供了新靶点——可能需要联合激活剂（如SH2D2A激动剂）与迁移促进剂（如SELPLG抑制剂）来平衡免疫效应与迁移能力。

最后，研究团队提出建立"人类肿瘤微环境-生物打印模型-动物模型"三级验证体系。建议后续研究应着重开发具有以下特征的模型：1）包含神经母细胞瘤特异性免疫抑制细胞群；2）具有三维结构复杂性和动态生物力学特性；3）整合临床样本的基因表达谱数据。只有建立更接近人类实体瘤环境的模型，才能准确预测CAR T细胞疗法的临床转归。