基因编辑揭示驱动蛋白-12调控棉铃虫对Bt毒素Cry1Ac的敏感性

《Scientific Reports》：Editing the kinesin-12 gene affects responses to Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa zea

本研究针对棉铃虫(Helicoverpa zea)对Bt作物抗性演化这一重大农业问题，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术，直接验证了驱动蛋白-12(kinesin-12)基因在调控对Cry1Ac毒素响应中的功能。研究团队在敏感品系中敲除kinesin-12导致抗性提升4倍，而在抗性品系中修复该基因突变则使敏感性增加3.8倍，为理解Bt毒素作用新模式及抗性治理提供了关键证据。

　　

在现代农业的绿色防线中，转基因Bt作物扮演着至关重要的角色。它们能够自身产生源自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)的杀虫蛋白，从而有效控制害虫，减少化学农药的使用，保护生态环境。然而，道高一尺魔高一丈，害虫也在不断进化以应对这一威胁。截至目前，全球已有至少11种害虫对Bt作物产生了抗性，其中棉铃虫(Helicoverpa zea)，又称玉米穗虫，对Bt棉花产生的主要毒素Cry1Ac的抗性问题尤为突出，已成为美国最具经济破坏力的害虫难题之一。

传统的观点认为，害虫对Bt毒素产生抗性主要与其中肠细胞表面的受体蛋白（如钙粘蛋白cadherin、氨肽酶-N、碱性磷酸酶、ABC转运蛋白等）发生突变有关，这些突变会减少毒素与受体的结合。然而，对于棉铃虫而言，尽管通过CRISPR/Cas9技术敲除ABCC2基因能导致高达40倍的Cry1Ac抗性，但基因组关联分析(GWAS)研究却显示，在田间或实验室筛选的抗性品系中，ABCC2及其他候选受体基因的突变并非抗性的主要因素。此前，一项针对实验室高抗品系GA-R的研究发现，一个名为驱动蛋白-12(kinesin-12)的基因出现了一个无义突变（C546T），导致蛋白质合成提前终止，并且该突变与抗性显著相关。驱动蛋白是一类重要的细胞内马达蛋白，参与细胞内的物质运输、细胞分裂等多种关键过程。但kinesin-12是否直接参与Bt毒素的毒性通路，以及其在抗性中的作用，尚缺乏直接的实验证据。

为了解开这个谜团，由美国农业部农业研究服务局（USDA ARS）的Chan C. Heu、Jeffrey A. Fabrick等人领导的研究团队，在《Scientific Reports》上发表了他们的最新研究成果。他们运用精确的基因编辑“剪刀”——CRISPR/Cas9技术，开展了互补性的功能验证实验：一方面，他们在敏感的LAB-S品系中敲除kinesin-12基因，观察是否会诱导产生抗性；另一方面，他们在抗性的GA-R品系中修复其天然存在的kinesin-12无义突变，检验是否能恢复其对Cry1Ac的敏感性。这项研究旨在为kinesin-12在Cry1Ac中毒过程中的作用提供最直接的证据。

研究人员主要运用了CRISPR/Cas9基因编辑技术来创建基因敲除(KinKO)和基因敲入(KinKI)品系，并采用饮食覆盖生物测定法来评估不同品系棉铃虫幼虫对Cry1Ac毒素的剂量-死亡率反应。实验使用的昆虫样本包括已知的敏感实验室品系LAB-S和实验室筛选的高抗品系GA-R。

结果

敲除kinesin-12使敏感品系产生抗性

研究人员成功利用两个sgRNA（HzkinKO_sgRNA1和HzkinKO_sgRNA2）在LAB-S品系中敲除了kinesin-12基因，创建了KinKO品系。测序证实KinKO个体携带导致蛋白质截短的无义突变。生物测定结果显示，KinKO品系对Cry1Ac的半致死浓度(LC₅₀)为0.89 μg/cm2，而亲本LAB-S品系的LC₅₀为0.22 μg/cm2，抗性比(RR)为4.0。在多个毒素浓度下，KinKO品系的幼虫存活率均显著高于LAB-S品系。这表明敲除kinesin-12确实导致了棉铃虫对Cry1Ac产生低水平但显著的抗性。

修复kinesin-12突变增加抗性品系的敏感性

相应地，研究人员在GA-R品系中，通过CRISPR/Cas9介导的同源定向修复(HDR)，利用单链寡核苷酸(ssODN)模板HzkinKI_ssODN，将其突变体等位基因(kin^GA-R)修复为野生型序列(kin^C)，创建了KinKI品系。生物测定表明，KinKI品系的LC₅₀(24.3 μg/cm2)比GA-R品系的LC₅₀(91.9 μg/cm2)降低了3.8倍。在大多数测试浓度下，KinKI品系的存活率也显著低于GA-R品系。这证明修复kinesin-12功能可以部分恢复GA-R品系对Cry1Ac的敏感性。

幸存者基因型确认

对生物测定中幸存幼虫的基因型分析进一步证实了基因编辑的效果。LAB-S的幸存者均携带野生型kin^LAB-S等位基因；KinKO的幸存者均携带敲除突变；而在高浓度毒素下存活的GA-R和KinKI幼虫，则分别只携带kin^GA-R和修复后的kin^C等位基因。

讨论与结论

本研究通过严谨的基因编辑功能获得性（KinKO）和功能缺失性（KinKI）实验，提供了令人信服的直接证据，表明kinesin-12基因参与调控棉铃虫对Bt毒素Cry1Ac的敏感性。然而，敲除kinesin-12仅引起4倍抗性，远低于GA-R品系的418倍抗性；同时，修复kinesin-12也只能部分恢复敏感性（KinKI的RR为111）。这强烈暗示，在GA-R品系中，除了kinesin-12突变外，还存在其他遗传因素共同贡献了其高水平的抗性。这与之前Benowitz等人的推测——kinesin-12突变是GA-R抗性的必要条件但非充分条件——部分吻合，但也在新的遗传背景（KinKI保留了GA-R的其他可能突变）下提出了挑战，表明kinesin-12在某些情况下并非绝对必要。

关于kinesin-12如何影响Bt毒素作用的机制，本研究并未直接阐明，但提出了两种可能的假说：其一，kinesin-12可能通过与肌球蛋白-II等相互作用，参与维持中肠微绒毛的细胞骨架结构，其缺失可能间接影响毒素受体的分布或完整性；其二，kinesin-12作为马达蛋白，可能参与将毒素受体运输至中肠细胞膜表面的过程，其功能失常可能导致受体错误定位，类似于在其他昆虫中观察到的由细胞运输障碍引起的抗性机制。

综上所述，这项研究不仅确认了一个新的与Bt抗性相关的基因，更重要的是揭示了Bt毒素作用模式可能比传统认知的“毒素-受体”二元相互作用更为复杂，涉及细胞内运输和细胞结构维持等更广泛的细胞生物学过程。这一发现为深入理解Bt毒素的作用机制和害虫抗性演化开辟了新的方向，对制定更可持续的害虫抗性治理策略具有重要的理论和实践意义。同时，研究结果也强调了实验室筛选与田间进化产生的抗性遗传基础可能存在差异，提醒在抗性监测和风险评估中需考虑这种复杂性。