CEBPB基因通过调控间充质干细胞增殖与分化影响猪脂肪生成的双重功能研究

《Journal of Applied Genetics》：The role of the CEBPB gene in porcine adipogenesis: a study using CRISPR/Cas9-edited mesenchymal stem cells

本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在猪脂肪来源间充质干细胞（MSCs）中成功构建CEBPB基因启动子区575-bp缺失模型，发现无论是纯合还是杂合缺失均会完全阻断脂肪生成过程，并显著降低细胞增殖能力。该研究首次揭示CEBPB在猪MSCs中兼具调控分化与增殖的双重功能，为优化猪胴体组成和人类肥胖研究提供了重要理论依据。

　　

在追求优质猪肉产品和攻克人类肥胖难题的双重驱动下，科学家们一直试图揭开脂肪细胞分化的神秘面纱。脂肪生成（Adipogenesis）作为脂肪组织发育的核心过程，不仅直接影响猪的生长速率、能量代谢和肉品品质，更因其与人类脂肪生物学的高度相似性，使猪成为研究肥胖及相关代谢疾病的理想大型动物模型。在这一复杂的分化过程中，转录因子网络扮演着指挥者的角色，其中CCAAT/增强子结合蛋白β（C/EBPβ）被认为是启动脂肪生成的关键早期调控因子。然而，尽管在人类和小鼠模型中CEBPB基因的功能已被广泛研究，其在猪脂肪生成中的具体调控机制，尤其是对细胞增殖的影响，仍是一片亟待探索的空白。

为了解决这一问题，由Mehmet Onur Aksoy、Jedrzej Rozynek、Monika Stachowiak和Izabela Szczerbal组成的研究团队在《Journal of Applied Genetics》上发表了一项创新性研究。他们利用前沿的CRISPR/Cas9基因编辑技术，精准靶向猪CEBPB基因的启动子区域，旨在揭示该基因缺失对猪间充质干细胞（MSCs）成脂分化和增殖能力的深层影响。研究结果出乎意料地发现，CEBPB的功能缺失不仅阻断了脂肪生成的全过程，更显著抑制了细胞的增殖活力，揭示了其在干细胞生物学中前所未有的双重功能。

本研究主要采用了以下几项关键技术方法：研究以猪脂肪来源的间充质干细胞（MSCs）为模型，通过CRISPR/Cas9系统设计并导入特异性靶向CEBPB基因启动子区的gRNA，经核转染和嘌呤霉素筛选获得基因编辑细胞克隆。通过PCR基因分型和Sanger测序验证了启动子区575-bp缺失的成功引入。利用实时荧光定量PCR（qPCR）技术，在脂肪诱导分化过程的第0、4、6、8、10天系统检测了成脂标志基因（GATA2、CEBPA、PPARG、FABP4）和增殖相关基因（CCND1、MCM2、PCNA）的转录水平变化。

CEBPB基因5'调控区域的表征

研究人员首先通过生物信息学分析对猪CEBPB基因的5'调控区进行了深入挖掘，发现该区域富含多个与脂肪生成相关的转录因子结合位点，包括TATA盒、CRE样元件、糖皮质激素反应元件（GRE）、编码序列起始位点（CDS）和转录起始位点（TSS）区域。基于此，他们精心设计了引导RNA（gRNA），旨在通过CRISPR/Cas9系统切除这一关键调控区域，为后续的功能缺失研究奠定基础。

CEBPB基因座的缺失引入

通过核转染技术将CRISPR/Cas9系统导入猪MSCs后，研究人员对单细胞来源的克隆进行了基因分型。结果显示，基因编辑效率达到22.9%，成功获得了1个纯合缺失克隆和10个杂合缺失克隆。PCR扩增和Sanger测序均证实，在目标区域精准地引入了575-bp的缺失，且未发现其他意外的插入或缺失突变（Indels），证明了编辑的高度特异性。

野生型MSC（MSC_WT）与启动子区缺失MSC（MSC_DEL）中CEBPB基因的表达谱

基因编辑的成功与否最终需要体现在基因表达的变化上。qPCR分析显示，与野生型细胞（MSC_WT）相比，携带纯合或杂合缺失的MSC_DEL细胞其CEBPB基因的转录水平显著降低。其中，杂合缺失细胞的CEBPB表达量仅为野生型的约1/11。在长达10天的成脂分化过程中，野生型细胞中CEBPB的表达在分化第4天出现特征性峰值，而MSC_DEL细胞在所有时间点的CEBPB表达均维持在极低水平。这一结果确凿地证明了所引入的启动子缺失有效抑制了CEBPB的转录活性。

MSC_WT和MSC_DEL中成脂相关基因的表达模式

为了评估CEBPB缺失对脂肪生成通路的影响，研究团队系统监测了关键成脂标志基因的表达动态。在野生型细胞中，GATA2在分化起始时（第0天）表达最高，随后逐渐下降；CEBPA和PPARG的表达则随分化进程逐步上调，至第10天达到峰值；FABP4作为成熟脂肪细胞的标志，其表达也持续增加。然而，在CEBPB启动子缺失的细胞中，这一完整的转录 cascade 被彻底打乱：GATA2、CEBPA和PPARG的表达均被显著抑制，FABP4的表达模式也出现异常。这些分子水平的异常与细胞表型完美对应——CEBPB缺失的细胞完全无法形成脂滴，即丧失了分化成脂肪细胞的能力。

MSC_WT和MSC_DEL增殖状态的评估

本研究的另一个重要发现是CEBPB对细胞增殖的调控作用。研究人员检测了细胞周期蛋白D1（CCND1）、微小染色体维持蛋白2（MCM2）和增殖细胞核抗原（PCNA）等增殖相关基因的表达。结果发现，与野生型细胞相比，无论是纯合还是杂合CEBPB缺失的MSC_DEL细胞，这些基因的转录水平均显著降低。尤其值得注意的是，纯合缺失的细胞在体外培养中表现出极差的生长状态，这从功能层面进一步证实了CEBPB是维持MSC增殖能力所必需的。

该研究的结论与讨论部分强调了CEBPB在猪脂肪生成中的核心地位。与最初假设不同，CEBPB的缺失（即使是杂合状态）并未导致脂肪生成能力的部分削弱，而是引起了完全且彻底的阻断。这种对基因剂量的高度敏感性提示了CEBPB可能存在“单倍体不足”（Haploinsufficiency）现象，即单个正常等位基因产生的蛋白量不足以维持正常的生物学功能。这凸显了在猪MSCs中，脂肪生成过程对CEBPB表达量的精确调控有着极其苛刻的要求。

更为重要的是，本研究首次将CEBPB的功能拓展至调控MSC的增殖领域。增殖相关基因的下调和纯合缺失细胞生长迟缓的表型共同表明，CEBPB不仅指挥着分化的“进程”，还掌控着细胞增殖的“开关”。这一发现与部分癌症研究中的观察相呼应，提示CEBPB在细胞周期调控中可能扮演着保守的角色。

从研究策略的角度，该工作也提供了宝贵的启示。靶向CEBPB这样的上游主调控因子，虽然能有效揭示其必要性，但由于其缺失导致分化进程的完全停滞，使得研究者难以继续探索该通路下游的精细调控机制。因此，对于未来旨在通过基因编辑改良猪脂肪沉积的研究，选择那些对细胞存活和增殖影响较小、但能特异性调节特定代谢通路（如脂质合成或能量稳态）的次级调控因子或效应分子，可能更能实现“精准调控”的目标。

综上所述，这项研究不仅深化了我们对CEBPB在猪脂肪生成中关键作用的理解，更重要的是揭示了其对间充质干细胞增殖的双重调控功能，为农业动物育种和人类代谢疾病研究提供了新的分子靶点和理论依据。该成果标志着我们在利用大型动物模型解析复杂生命过程的道路上又迈出了坚实的一步。