基因编辑猪中甲型流感病毒传播的阻断

基因编辑猪阻断流感A病毒传播。研究显示，敲除TMPRSS2基因的猪感染H1N1后鼻腔排毒量少，无法通过接触传播给同源KO猪，对WT猪的传播也显著延迟。这说明TMPRSS2在病毒跨物种传播中起关键作用，为防控猪流感提供新思路。

　　
### 研究背景与意义
流感A病毒（IAV）对全球畜牧业和公共卫生构成重大威胁。猪作为IAV的中间宿主，其感染不仅导致直接经济损失，还可能通过病毒基因重组产生新亚型，进而引发人畜共患病。近年来，基因编辑技术为宿主抗病毒提供了新思路。例如，敲除CD163基因的猪对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）完全免疫，而敲除ANP32A基因的鸡对IAV具有抗性。这一领域的关键挑战在于如何通过宿主基因编辑有效阻断病毒传播，同时避免病毒通过其他途径逃逸。

### 实验设计与目标
研究团队利用CRISPR-Cas9技术，成功生成并验证了缺乏TMPRSS2基因的猪（KO猪）。TMPRSS2作为病毒受体激活酶，在IAV感染中起关键作用。此前研究显示，KO猪的鼻腔病毒排泄量显著低于野生型（WT）猪，但病毒仍可在肺部复制并引发病理变化。本研究旨在评估KO猪对IAV传播的影响，通过三组对照实验明确其防控潜力：
1. **WT-to-WT组**：分析野生猪自然传播规律；
2. **KO-to-KO组**：验证基因敲除是否阻断病毒在KO猪间的传播；
3. **KO-to-WT组**：评估KO猪感染后对WT猪的传播效率。

实验采用分室共居设计，所有猪在感染前均经HA试验和NP ELISA确认为阴性。病毒接种后，通过鼻腔拭子动态监测病毒载量，结合病理学评估和血清学检测，综合判断传播阻断效果。

### 关键实验结果
#### 1. 病毒传播动态分析
- **WT-to-WT组**：感染猪在接种后4-5天达到鼻腔病毒排泄高峰（平均滴度10^4.86 TCID50/mL），哨兵猪在接触后5.33±0.52天开始排毒，至第12天全部转为阳性，表明病毒在WT猪间高效传播。
- **KO-to-KO组**：感染猪仅在1天时检测到微量病毒（1/5猪），接触后哨兵猪未出现排毒，证实基因敲除完全阻断了病毒在KO猪间的水平传播。
- **KO-to-WT组**：感染KO猪的鼻腔排毒高峰延迟至第3天（平均滴度10^3.25 TCID50/mL），哨兵WT猪在接触后8.67±1.03天开始排毒，且排毒持续时间（9-19天）显著长于自然感染组（5-12天），表明KO猪的病毒载量较低且释放更缓慢，间接抑制了病毒传播效率。

#### 2. 病毒复制与病理学特征
- **肺部感染**：所有感染猪（WT和KO）在5天时均从支气管肺泡灌洗液（BALF）检测到病毒，表明病毒成功入侵下呼吸道。KO猪的肺部病理评分显著低于WT猪（p<0.05），但均出现肺泡炎和间质浸润等典型病变。
- **鼻腔屏障作用**：KO猪的鼻腔黏膜未检测到病毒（5天时BALF仍阳性），提示TMPRSS2缺失可能阻断了病毒在上呼吸道的外壳融合过程，导致病毒无法定植于鼻腔上皮细胞。

#### 3. 免疫应答差异
- **KO猪的免疫抑制**：KO猪的HI抗体滴度（几何均值±标准差）显著低于WT猪（p=0.0022），表明病毒未充分激活KO猪的免疫系统。
- **哨兵猪的血清学变化**：KO哨兵猪全程保持阴性，而WT哨兵猪在感染后21天全部转为阳性，证实KO猪无法通过直接接触传播病毒至其他猪。

### 科学意义与潜在应用
#### 1. TMPRSS2的功能解析
研究揭示了TMPRSS2在病毒传播中的双重作用：
- **上呼吸道传播枢纽**：作为HA蛋白的激活酶，TMPRSS2缺失直接阻断了病毒在上呼吸道的复制与排泄；
- **下呼吸道复制调节者**：尽管KO猪鼻腔排毒受限，但病毒仍通过其他蛋白酶（如TMPRSS4、TMPRSS11D）完成下呼吸道感染，提示需联合敲除其他宿主因子以实现完全免疫。

#### 2. 基因编辑猪的防控价值
- **经济收益**：若将KO猪引入商业化养殖，可减少因IAV感染导致的直接损失（如发热、肺炎）和隐性损失（如种猪繁殖能力下降）。
- **人畜共患病防控**：KO猪的病毒传播能力显著降低（R0值从WT组的10.66降至KO组的0.3-0.5），可能减少病毒跨物种传播的风险。

#### 3. 技术挑战与未来方向
- **基因逃逸风险**：已有研究显示，鸡的ANP32A基因突变可能被病毒通过替代蛋白利用。本实验未检测到HA cleavage site突变，但需长期追踪KO猪的病毒适应性。
- **多基因协同调控**：IAV依赖复杂宿主蛋白酶网络（如Furin、TACE），未来研究需探索敲除TMPRSS2与其他关键蛋白（如SLC5A8）的协同效应。

### 结论
基因编辑技术通过敲除TMPRSS2基因，显著抑制了IAV在猪群中的传播。KO猪自身虽能完成下呼吸道感染，但无法将病毒扩散至接触猪，这一发现为开发抗病毒基因编辑动物提供了理论依据。后续研究需结合分子流行病学监测，评估长期应用中病毒变异的可能性，以及基因编辑猪对猪群生态平衡的影响。