基于微滤膜机械穿孔的CRISPR/Cas9基因编辑技术揭示FKBPL在先兆子痫中作用机制

《Cell Death & Disease》：CRISPR/Cas9-mediated gene editing in trophoblast cells via mechanoporation for preeclampsia insight

本研究针对先兆子痫中滋养层细胞功能异常的治疗难题，开发了基于微滤膜的机械穿孔（MFP）技术，成功实现了CRISPR/Cas9质粒DNA在滋养层细胞的高效递送。研究人员通过部分敲除FKBPL基因，发现其表达下调会显著抑制细胞迁移和增殖功能，而间充质干细胞来源的小细胞外囊泡（MSC-sEVs）对FKBPL缺陷细胞的修复作用有限。该研究为胎盘生物学研究提供了新的基因编辑技术方案，并为先兆子痮治疗策略开发提供了重要理论依据。

　　

在妊娠并发症中，先兆子痫（preeclampsia）是一种严重的疾病，其特征是胎盘功能异常和滋养层细胞（trophoblast cells）功能障碍，导致显著的母婴发病率和死亡率。这种疾病通常发生在妊娠20周后，影响2-8%的妊娠。胎盘的健康依赖于滋养层细胞的正常迁移、侵袭和增殖，这些过程的异常与先兆子痫的发病机制密切相关。FK506结合蛋白样（FKBPL）基因在调节滋养层细胞动态中起着关键作用，但在先兆子痫早期患者中表达显著下调。然而，由于递送效率低和细胞存活率差，使用CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）/Cas9（CRISPR相关蛋白9）技术编辑FKBPL基因在滋养层细胞中一直面临挑战。

为了解决这些难题，研究人员开展了一项创新性研究，开发了一种成本效益高且微创的机械穿孔（mechanoporation，MFP）系统，通过微工程过滤器将CRISPR/Cas9质粒DNA靶向递送到滋养层细胞中。该研究不仅成功建立了FKBPL部分敲除（knockout，K/O）的细胞模型，还深入探讨了FKBPL在滋养层细胞功能中的作用以及间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）来源的小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）的治疗潜力。研究成果发表在《Cell Death & Disease》期刊上，为胎盘生物学研究和先兆子痫治疗提供了新的见解。

在技术方法上，研究人员首先优化了电穿孔和MFP系统，使用70 kDa FITC-葡聚糖作为模型分子评估递送效率和细胞存活率。通过流式细胞术分析，确定了MFP在1.5 ml/min流速下能达到91.7%的递送效率和72.8%的细胞存活率，显著优于电穿孔。随后，利用MFP系统将靶向FKBPL的CRISPR/Cas9质粒DNA转染到ACH-3P滋养层细胞中，并通过荧光激活细胞分选术（FACS）分离GFP阳性细胞进行克隆扩增。通过Western Blotting和Sanger测序验证FKBPL敲除效率，并利用MTT法和划痕实验评估细胞增殖和迁移功能。此外，从人骨髓来源的MSCs中分离sEVs，通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）、Western Blotting和扫描电子显微镜（SEM）进行表征，并研究其在内化后对细胞功能的影响。

Placental Fkbpl expression increases across gestation

通过对36例人类胎盘样本（包括早孕期、早产期和足月期）的qPCR分析，发现FKBPL mRNA表达在妊娠过程中显著增加。早孕期表达水平较低，但在早产期显著上升，并在足月期维持稳定，表明FKBPL在胎盘发育中可能发挥重要作用。

MFP delivers FITC dye at high efficiency with improved cell survival

优化实验显示，MFP系统在1.5 ml/min流速下能实现91.7%的70 kDa FITC-葡聚糖递送效率，且细胞存活率达72.8%，显著高于电穿孔（42%存活率）。这表明MFP是一种高效且细胞友好的递送方法。

MFP delivers CRISPR/Cas9 pDNA with greater cell survival

与脂质转染和电穿孔相比，MFP转染的细胞虽GFP阳性比例较低，但GFP信号强度更高，且存活克隆数量更多（增加两倍）。Western Blotting证实MFP能有效降低FKBPL蛋白表达，其中克隆K/O23显示完全敲除。

MSC-derived sEVs are internalised by trophoblasts

从MSCs分离的sEVs经表征确认其典型标志物（CD9、CD63、CD81）表达，平均粒径为126 nm。共聚焦显微镜显示sEVs能在4-6小时内被滋养层细胞内化，但FKBPL敲除细胞的内化效率延迟。

FKBPL-K/O impairs proliferation and migration in first trimester trophoblast cells, with MSC-sEVs offering partial rescue

部分敲除FKBPL（17%和38%）显著抑制了细胞增殖（野生型1.26±0.06 vs. K/O23 0.64±0.08）和迁移（野生型28.77%±4.7 vs. K/O23 4.95%±0.8）。MSC-sEVs处理能提高野生型细胞增殖，但对FKBPL敲除细胞无修复作用，迁移功能也未恢复。

研究结论表明，MFP系统能高效递送CRISPR/Cas9系统至滋养层细胞，且部分敲除FKBPL即可模拟先兆子痫早期的细胞表型，证实FKBPL在滋养层功能中的关键作用。MSC-sEVs对FKBPL缺陷细胞的有限修复作用提示FKBPL可能是其治疗机制的重要靶点。该研究不仅推进了胎盘生物学中的基因编辑技术，还为先兆子痫的机制研究和治疗策略提供了新方向。未来研究需进一步探索FKBPL调控的具体分子通路，并在原代细胞和动物模型中验证MFP技术的普适性。