CRISPR-Cas12a整合型妊娠试纸生物传感器：在宫颈癌诊断中可视化检测端粒酶和miRNA let-7a

《Biosensors and Bioelectronics》：CRISPR-Cas12a-integrated pregnancy test strip biosensors: Visual detection of telomerase and miRNA let-7a in cervical cancer diagnostics

本研究开发了两种CRISPR-Cas12a-integrated生物传感器，结合商用妊娠试纸条实现无需PCR的端粒酶和miRNA let-7a的快速检测，灵敏度达18 HeLa细胞和25.1 fM，临床验证显示与金标准一致，为资源有限地区的宫颈癌早筛提供便携工具。

　　宫颈癌是全球女性癌症相关死亡的主要原因之一，早期筛查对于改善预后至关重要。当前的检测方法存在诸多局限，如复杂的操作流程、高昂的仪器成本以及对专业技术人员的依赖，这在资源有限的地区尤为突出。为了解决这些问题，研究人员开发了两种基于CRISPR-Cas12a系统的新型生物传感器，并结合市面上的妊娠测试条（PTS），实现了无需仪器、可视化读数的检测方法。这两种生物传感器不仅简化了操作流程，还降低了检测成本，提高了检测的可及性和便捷性。

本研究中，研究人员首先开发了Biosensor CRISPR-PTS-Telo，用于检测宫颈癌中常见的端粒酶活性。端粒酶是一种关键的细胞永生化驱动因子，其主要功能是通过添加端粒重复序列（TTAGGG）n来维持染色体末端的长度，从而防止细胞衰老和凋亡。在宫颈癌组织中，端粒酶的异常激活被观察到超过85%的病例，这使其成为监测恶性转化风险的重要指标。Biosensor CRISPR-PTS-Telo利用CRISPR-Cas12a系统与妊娠测试条的结合，实现了对端粒酶活性的一步式、无需聚合酶链式反应（PCR）的检测。当端粒酶作用于特定的底物引物，生成端粒重复序列（TTAGGG）n时，Cas12a-crRNA1复合物会特异性地识别并结合这些序列，从而激活Cas12a的转切割活性。这种活性能够切割探针1（“MB-ssDNA1-hCG”），释放出人绒毛膜促性腺激素（hCG）。随后，通过磁性分离处理反应液，释放出的hCG会与妊娠测试条发生反应，引发颜色变化，从而实现视觉诊断。该方法的检测限达到了18个HeLa细胞，与高灵敏度的实验室检测方法相当。

为了进一步提升检测的灵活性和适用性，研究人员还开发了Biosensor CRISPR-PTS-let7a，用于检测miRNA let-7a。miRNA let-7a是一种在宫颈癌组织或血清中显著下调表达的肿瘤抑制因子。在Biosensor CRISPR-PTS-let7a的设计中，引入了辅助DNA和探针2（“MB-ssDNA2+Trigger”），使得miRNA let-7a信号能够被转化为Trigger DNA。当存在miRNA let-7a时，Trigger DNA会被释放出来，并与Cas12a-crRNA2复合物结合，激活其转切割活性。这种活性不仅能够切割探针1（“MB-ssDNA1-hCG”），还会导致hCG的释放。在进行磁性分离处理后，释放出的hCG会与妊娠测试条发生反应，引发颜色变化，实现对miRNA let-7a的可视化检测。该方法的检测限为25.1飞摩尔（fM），显示出极高的灵敏度。

为了验证这两种生物传感器的有效性，研究人员使用了24个宫颈组织样本和26个血液样本进行临床测试。测试结果表明，这两种生物传感器的检测结果与金标准方法（如ELISA用于端粒酶检测，RT-qPCR用于miRNA let-7a检测）高度一致。这不仅证明了其在临床应用中的可靠性，也为其在资源有限地区的推广奠定了基础。

本研究中使用的CRISPR-Cas12a系统是一种革命性的基因编辑工具，它能够通过其独特的核酸切割能力，实现对特定目标序列的高效识别和切割。这一特性使得CRISPR-Cas12a系统在生物传感器开发中具有显著优势。与传统的检测方法相比，基于CRISPR-Cas12a的生物传感器能够更快速、更经济地进行检测，同时也减少了对复杂设备和专业人员的依赖。此外，妊娠测试条作为一种常见的商业化产品，具有操作简便、成本低廉和结果易于解读等优点，这为CRISPR-Cas12a系统的实际应用提供了理想的基础。

在本研究中，研究人员还对两种生物传感器的性能进行了优化，以确保其在实际应用中的稳定性和可靠性。例如，在Biosensor CRISPR-PTS-Telo的设计中，通过调整探针1的结构和Cas12a-crRNA1复合物的结合条件，实现了对端粒酶活性的高灵敏度检测。而在Biosensor CRISPR-PTS-let7a的设计中，引入了辅助DNA和探针2，使得miRNA let-7a的检测过程更加灵活和高效。这些优化措施不仅提高了检测的准确性，还增强了生物传感器在不同样本类型中的适用性。

值得注意的是，在使用这两种生物传感器进行检测时，需要首先排除妊娠或其他可能导致hCG水平升高的情况，以避免出现假阳性结果。这一要求在实际应用中需要特别注意，尤其是在使用血液样本进行检测时，由于血液样本中hCG的水平可能受到多种因素的影响，因此需要进行严格的样本预处理和条件控制。通过这种方式，研究人员确保了检测结果的可靠性和准确性，同时降低了误诊的风险。

总的来说，这两种基于CRISPR-Cas12a系统的生物传感器（CRISPR-PTS）为宫颈癌的早期筛查提供了一种新的解决方案。它们不仅简化了检测流程，还显著降低了检测成本，使得在资源有限的地区也能实现高效、准确的宫颈癌筛查。此外，这些生物传感器还具有较高的灵敏度和特异性，能够满足不同应用场景下的检测需求。通过进一步的优化和推广，这些工具有望成为点对点检测（POCT）领域的重要组成部分，为全球范围内的宫颈癌防控工作提供强有力的支持。

本研究的成果对于推动精准医疗和提高癌症筛查的可及性具有重要意义。在实际应用中，这些生物传感器可以用于现场快速检测，无需复杂的实验室设备和专业技术人员的参与，这使得它们特别适合在基层医疗机构和偏远地区使用。此外，这些工具的开发也为其他疾病的早期诊断提供了新的思路和方法。通过结合CRISPR-Cas12a系统的高效识别能力和妊娠测试条的可视化读数特性，研究人员成功地构建了一种简单、快速且灵敏的检测平台，为未来的疾病筛查技术发展提供了重要的参考价值。

在未来的应用中，这些生物传感器不仅可以用于宫颈癌的筛查，还可以扩展到其他癌症或疾病的早期诊断。例如，通过调整探针和crRNA的设计，可以针对不同的生物标志物开发相应的检测方法。此外，这些传感器还可以与智能手机或其他便携式设备结合，实现更加智能化和自动化的检测流程。这种技术的融合将进一步提升检测的便捷性和准确性，为公共卫生领域带来深远的影响。

为了确保这些生物传感器的广泛应用，研究人员还对实验材料和方法进行了详细的描述。在材料部分，所有实验所用的试剂和仪器均来源于商业渠道，确保了实验的可重复性和可操作性。在方法部分，研究人员详细说明了如何利用CRISPR-Cas12a系统和妊娠测试条进行检测，包括反应条件的优化、探针的设计以及磁性分离等关键步骤。这些详细的实验方案不仅为其他研究者提供了参考，也为后续的临床推广奠定了坚实的基础。

本研究的伦理声明表明，所有涉及人类受试者的实验均遵循了相关的伦理标准，包括获得伦理委员会的批准和受试者的知情同意。这一严格的伦理审查确保了研究的科学性和伦理性，同时也体现了研究人员对受试者权益的重视。此外，研究团队还声明没有与本研究相关的利益冲突，这进一步增强了研究结果的可信度和客观性。

通过本研究的成果，研究人员不仅在技术层面实现了突破，也在应用层面提供了可行的解决方案。这些生物传感器的开发和应用，为宫颈癌的早期筛查提供了一种全新的工具，有望在未来的医疗实践中发挥重要作用。同时，这些工具的推广和使用，也将有助于提高全球范围内宫颈癌筛查的覆盖率和效率，从而降低宫颈癌的发病率和死亡率。

总之，本研究的创新之处在于将CRISPR-Cas12a系统与妊娠测试条相结合，开发出两种高效的生物传感器，用于宫颈癌相关生物标志物的检测。这些工具不仅具有高灵敏度和特异性，还具备操作简便、成本低廉和结果易于解读等优点，为宫颈癌的早期筛查提供了新的可能性。未来，随着技术的进一步发展和优化，这些生物传感器有望在更多领域得到应用，为疾病的早期诊断和治疗提供强有力的支持。