代谢物响应型支架RNA：动态CRISPR转录调控的新突破

《Nucleic Acids Research》：Metabolite-responsive scaffold RNAs for dynamic CRISPR transcriptional regulation

本研究针对现有CRISPR激活(CRISPRa)系统缺乏动态调控能力的问题，开发了一种名为代谢物响应型支架RNA(MR-scRNA)的新型分子开关。研究人员通过将RNA开关嵌入向导RNA，实现了在细菌、酵母和哺乳动物细胞中对靶基因的代谢物诱导型激活。该技术成功应用于色氨酸响应型动态调控，使紫色杆菌素产量提高10倍，为生物传感器、微生物工厂和条件性疗法提供了通用型调控工具。

　　

在合成生物学和代谢工程领域，微生物已被成功改造成能够将简单底物转化为大宗化学品、复杂天然产物和治疗药物的"活工厂"。然而，要最大化细胞生产力、滴度和产量，需要精细协调控制天然代谢途径和异源酶的表达。传统方法主要通过筛选启动子或核糖体结合位点库来静态优化途径酶表达，但这种静态基因调控无法应对细胞生命周期中显著变化的细胞环境，导致资源管理不当和性能欠佳。

相比之下，动态调控策略旨在通过循环切换生长状态和生产状态来平衡细胞的竞争需求。理想情况下，细胞能够解读重要的生理信号（如分支点代谢物浓度）来调控生产酶的表达，从而实现更好的资源分配和更高的产物滴度。CRISPR-Cas转录调控系统作为一种精确控制基因表达的方法，通过向导RNA的间隔序列与目标位点的互补配对，实现了对CRISPR激活(CRISPRa)或CRISPR抑制(CRISPRi)复合物的可编程靶向。

然而，大多数基于CRISPR的基因控制系统本质上是静态的。虽然已有一些输入响应型CRISPR转录控制系统的报道，但这些方案依赖于有限的化学诱导蛋白-蛋白质相互作用，只能响应少数必须外源供应的化学品，或者依赖在实际应用中不具可行性的光控系统。RNA适体则能够选择性结合多种分子，并可直接嵌入sgRNA，从而最大限度地减少动态细胞调控所需的组件数量。但现有的大多数小分子响应型sgRNA设计受到宿主范围、调控机制可逆性以及转录激活调控能力的限制。

为了设计一种通用的动态调控策略，本研究团队开发了一类高效自包含的RNA开关，将化学输入的结合与蛋白质靶标的结合联系起来。这些RNA开关在目标代谢物与其对应适体结合时，有条件地形成MS2噬菌体外壳蛋白(MCP)结合发夹。在CRISPRa的一个版本中，转录激活剂与MCP翻译融合，并组成型招募到位于支架sgRNA(scRNA)3'末端的MS2适体上。通过用RNA开关替换这种静态发夹，研究人员设计了代谢物响应型支架RNA(MR-scRNA)，能够在原核生物（大肠杆菌）和真核细胞（酿酒酵母和HEK293T）中实现条件性CRISPRa。

研究人员选择了10个先前通过体外高通量筛选鉴定的性能最佳的可可碱响应型RNA开关，将它们替换原始scRNA中的静态MCP结合发夹，创建了一套可可碱MR-scRNA。通过靶向大肠杆菌中单体红色荧光报告基因(mRFP1)上游的工程化最小启动子，在可可碱存在和不存在的情况下检测了MR-scRNA的活性。10个可可碱MR-scRNA设计中有6个在可可碱处理时mRFP1表达显著增加，其中3个MR-scRNA对目标代谢物的响应超过5倍。

关键实验技术方法包括：质粒构建采用标准分子克隆技术；MR-scRNA表征通过荧光报告基因表达分析；动力学研究采用流式细胞术；代谢物检测使用高效液相色谱(HPLC)系统；真核细胞实验涉及酵母和哺乳动物细胞系的转染和诱导；内源性基因激活通过RT-qPCR验证。

MR-scRNA灵敏度、特异性和响应动力学

研究人员进一步表征了可可碱MR-scRNA在大肠杆菌中条件性调控基因激活的能力。通过滴定不同浓度的可可碱，发现MR-scRNA在100-2500μM可可碱浓度范围内呈现线性响应。评估MR-scRNA特异性时发现，虽然咖啡因（与可可碱结构相似的甲基黄嘌呤）处理细胞产生类似的毒性 profile，但MR-scRNA不对咖啡因产生响应。

通过动力学实验发现，在代谢物添加或去除后1小时内即可观察到mRFP1水平的显著变化。将细胞在含或不含可可碱的培养基间反复传代时，细胞按预期在开和关状态间循环响应目标配体。约90%的处理细胞表现出对可可碱刺激的可检测响应。

MR-scRNA在真核生物中调控基因表达

为验证MR-scRNA在真核细胞中的通用性，研究人员将MR-scRNA移植到酵母和人类细胞CRISPR激活框架中。唯一需要的修改是给蛋白质组件添加核定位信号肽，并将细菌转录激活剂SoxS替换为真核生物兼容的VP64-p65-Rta(VPR)。除了替换间隔序列外，未对MR-scRNA设计进行任何更改。

在酵母实验中，表达MR-scRNA的细胞仅在可可碱存在时显示mVenus表达增加18.5倍。在人类细胞实验中，只有表达MR-scRNA的HEK293T细胞在可可碱处理后显示报告基因表达增加，并观察到与大肠杆菌中相似浓度范围的剂量依赖性响应。

MR-scRNA调控内源性基因表达

CRISPR调控的一个关键优势是能够可编程地靶向基因，而无需启动子编辑或工程化。研究人员测试了MR-scRNA能否条件性控制内源性基因表达，通过靶向肌联蛋白(TTN)的MR-scRNA，发现可可碱处理细胞的TTN表达显著高于未处理细胞。研究人员还探索了MR-scRNA是否与具有扩展PAM范围的替代dCas9变体（如工程化SpRY变体）类似地发挥作用，发现使用dCas9或dSpRY的条件性基因激活水平相似，这大大扩展了MR-scRNA系统可靶向的基因数量。

使用响应天然代谢物的MR-scRNA进行动态代谢调控

研究人员进一步设计了能够感知和响应天然代谢物的MR-scRNA。色氨酸是许多天然产物和药用化合物生物合成的前体，同时也是蛋白质合成和生长必需的氨基酸。考虑到色氨酸浓度的动态调控策略可以提供改进的产物滴度和产量，研究人员创建了色氨酸响应型scRNA，用作代谢开关，在色氨酸水平高时在生长和生产状态间转换。

基于最初筛选可可碱响应型scRNA的高命中率，研究人员通过简单地将该代谢物体外筛选中的最高排名RNA开关实施到scRNA中，生成了单个色氨酸MR-scRNA。在补充或不含色氨酸的确定培养基中培养表达这种新MR-scRNA设计的大肠杆菌菌株，发现只有具有色氨酸MR-scRNA的细胞显示条件性基因激活。

色氨酸MR-scRNA对其同源配体呈现剂量依赖性行为，最低可检测浓度为250μM，最大响应为2.8倍。将色氨酸MR-scRNA移植到酵母中，能够在该宿主中对色氨酸产生轻微但显著的响应。

验证色氨酸响应型MR-scRNA后，研究人员随后寻求动态调控紫色杆菌素生产。紫色杆菌素是一种天然存在的紫色色素，具有抗菌和抗肿瘤特性，通过五酶级联(VioABECD)从色氨酸合成。

比较大肠杆菌中紫色杆菌素生产，发现色氨酸MR-scRNA产生的紫色杆菌素比脱靶scRNA对照多9.9倍，且无明显生长缺陷。自调控与色氨酸MR-scRNA证明是有用的，尽管可可碱MR-scRNA诱导的mRFP1表达水平高于色氨酸MR-scRNA，但该策略导致紫色杆菌素比可可碱MR-scRNA多3.6倍。有趣的是，在任何实验中，具有靶向scRNA的培养物均未检测到紫色杆菌素产量。

研究结论与意义

本研究提出的MR-scRNA作为一种可编程且通用的代谢物诱导型CRISPR转录激活工具，能够在跨越生命树三个不同物种中发挥作用，因此可能可移植到许多其他宿主。研究表明，能够生成响应替代代谢物的MR-scRNA，且通过使用色氨酸响应型MR-scRNA使细胞自我调控前体水平，从而实现更有效的细胞生长和紫色杆菌素生物合成，证明了MR-scRNA在动态代谢工程中的实用性。

MR-scRNA与其他配体诱导型CRISPRa平台相比具有几个潜在优势：通过顺式作用RNA开关而非传统化学诱导二聚化(CID)结构域调控基因调控，最大限度地减少了必须表达的生物组件数量，降低了调控系统存在的负担。此外，依赖CID的配体诱导型CRISPRa系统限于可用小分子数量，而MR-scRNA可能检测的输入范围显著更广，因为已有数百种天然和合成RNA适体被识别。

MR-scRNA设计通过将调控控制点转移到效应器招募基序而非Cas9结合发夹，保留了天然sgRNA-Cas9相互作用。将代谢物感应域嵌入gRNA现有功能元件之外，可能最大限度地减少dCas9结合能力的损害。与其他RNA调控系统（如核糖开关或核酶）相比，MR-scRNA具有增强的动态范围，且能够在不进行遗传重编程的情况下靶向异源和内源性基因。

MR-scRNA系统需要进一步优化以减少未结合"关闭"状态的基础激活，并改善配体结合"开启"状态的基因激活。根据具体MR-scRNA变体和应用，背景基因表达在非靶向对照的约1倍至约10倍之间变化。仔细平衡MR-scRNA与MCP激活剂的比例可能减少这两个组件的非特异性结合。激活MR-scRNA的最大输出低于静态scRNA，可能通过"开启"状态RNA开关的降低亲和力解释。

MR-scRNA设计利用了在线游戏Eterna生成的优秀RNA开关以及Das和Greenleaf实验室进行的高通量筛选。这些RNA开关之前未在细胞内活性方面进行表征，在本次测试中出乎意料地稳健（11个测试变体中有7个功能变体），尽管原始筛选条件与测试的细胞内环境存在显著差异。这种RNA设计空间为开发响应其他代谢物的MR-scRNA提供了机会。

总之，MR-scRNA为代谢物响应型转录控制提供了一个有前景的平台。研究表明，MR-scRNA能够以最小修改适应响应新输入或在不同环境背景下发挥作用，同时保持基于CRISPR的转录调控器的现有功能性。除了作为动态调控器，响应产物或途径中间体的MR-scRNA可用作生物传感器，筛选库以进行途径优化或酶工程。MR-scRNA还扩展了哺乳动物合成生物学中基因回路调控可用的正交输入数量。总体而言，MR-scRNA显示的有利配体响应特性和多功能性为条件性调控基因表达提供了一个广泛有用的工具。