53BP1-RIF1与DNA-PKcs在染色体断裂修复中的独特遗传相互作用揭示不同修复结局的调控机制

《Nature Communications》：53BP1-RIF1 and DNA-PKcs show distinct genetic interactions with diverse chromosomal break repair outcomes

本研究针对53BP1在DNA双链断裂（DSB）修复中与经典非同源末端连接（NHEJ）通路（如DNA-PKcs）的遗传相互作用尚不明确的问题，通过多种染色体断裂修复报告系统，揭示了53BP1-RIF1在DNA-PKcs功能受损时对平末端DSB NHEJ起备份作用，但在抑制微同源介导的缺失突变方面与DNA-PKcs处于同一通路。该发现阐明了关键DNA损伤应答因子在调控不同修复结局中的复杂关系，对理解基因组稳定性维持及癌症治疗策略具有重要意义。

　　

当细胞的染色体DNA发生双链断裂（DSB）时，一场精密的修复大战随即在细胞核内上演。这种断裂可能源于正常的生理过程，也可能由放疗等癌症治疗手段或基因编辑工具（如CRISPR-Cas9）引起。如果修复不当，断裂的染色体可能导致细胞死亡或癌变。细胞拥有多种修复工具，其中，同源定向修复（HDR）类似于使用“姐妹染色单体”作为模板进行精确复制，而非同源末端连接（NHEJ）则更像是直接将断裂两端“粘合”起来，虽然快捷但容易出错。在NHEJ修复队伍中，DNA-PKcs（DNA依赖性蛋白激酶催化亚基）是核心成员，它负责将断裂的末端拉近并调控末端处理过程。而另一个关键蛋白53BP1，虽然也被认为参与NHEJ，但它与DNA-PKcs等核心NHEJ因子如何协作，特别是在不同修复结局（如是否产生插入/缺失突变）中的具体作用，一直是领域内亟待厘清的问题。

为了解决这些问题，由Kaela Makins、Metztli Cisneros-Aguirre、Felicia Wednesday Lopezcolorado和Jeremy M. Stark组成的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们利用先进的细胞模型和基因编辑技术，深入探究了53BP1及其效应蛋白RIF1与DNA-PKcs在调控多种DSB修复结局中的复杂遗传关系。

研究者们主要运用了以下几种关键技术方法：1) 染色体整合的荧光报告基因 assays（如EJ7-GFP报告基因用于检测无插入/缺失的末端连接，LMNA-HDR报告基因用于检测同源定向修复），通过流式细胞术定量修复效率；2) MTAP/CDKN2B-AS1缺失（MA-del）重排报告系统，结合深度测序分析修复连接处的序列特征，从而详细分类无插入/缺失连接、插入、缺失和复杂 indel 等多种修复结局；3) 利用CRISPR-Cas9技术构建53BP1、RIF1、DNA-PKcs（PRKDC）和XLF的基因敲除（KO）细胞系；4) 使用DNA-PKcs特异性激酶抑制剂M3814进行药理学抑制；5) 免疫印迹法验证蛋白表达和磷酸化水平；6) 克隆形成实验评估细胞在电离辐射（IR）后的存活能力。

Combining loss of 53BP1 with an inhibitor of DNA-PKcs causes a decrease in No Indel EJ

研究人员首先使用EJ7-GFP报告系统检测平末端DSB的无插入/缺失末端连接（No Indel EJ）。他们发现，单独敲除53BP1对No Indel EJ频率没有显著影响，但在使用DNA-PKcs抑制剂M3814处理后，53BP1的缺失会显著加剧M3814引起的No Indel EJ下降。这表明，在DNA-PKcs功能被抑制时，53BP1对于维持平末端DSB的精确连接起着重要的备份作用。

Combining loss of 53BP1 with either a DNA-PKcs inhibitor or genetic loss causes a decrease in DSB blunt EJ

为了验证上述发现并扩展分析其他EJ结局，研究人员使用了MA-del assay。该 assay 可同时检测无插入/缺失连接、插入、缺失和复杂 indel 等多种修复产物。结果证实，DNA-PKcs的抑制（M3814）或基因敲除（PRKDC-KO）会导致No Indel EJ和插入频率下降，缺失频率上升。而53BP1的单独缺失仍无显著影响，但当与DNA-PKcs disruption结合时，会进一步降低No Indel EJ和插入频率，并增加缺失频率。对插入序列的分析表明，大部分插入事件源于Cas9产生的5‘突出端被填充后进行的平末端EJ，进一步支持了53BP1在平末端EJ中的备份作用。

53BP1 loss and DNA-PKcs disruption, alone and together, cause a similar shift in deletion patterns

53BP1 loss and DNA-PKcs disruption, alone and together, cause a similar increase in microhomology usage for deletions

除了修复频率，研究人员还深入分析了缺失突变的模式。他们发现，无论是单独缺失53BP1，还是抑制/敲除DNA-PKcs，都会导致相似的缺失模式改变：即与微同源（≥2 nt）相关的特定缺失（如-2, -7, -75 nt）频率增加，而无微同源（0-1 nt）的缺失频率减少。当同时干扰53BP1和DNA-PKcs时，这种效应并非叠加，而是与单独干扰其中之一相似。这表明53BP1和DNA-PKcs在抑制微同源缺失方面可能处于同一遗传通路，这与它们在平末端EJ频率调控中的备份关系截然不同。

Loss of 53BP1 causes a decrease in DSB blunt EJ in XLF-deficient cells

Loss of 53BP1 and XLF causes distinct deletion patterns, and the effect of 53BP1 dominates in the double mutant

XLF是另一个核心NHEJ因子。研究人员发现，在XLF缺失的细胞中，53BP1对于残余的No Indel EJ至关重要，其缺失会进一步降低修复效率。然而，在缺失模式上，XLF缺失主要导致-17至-35 nt的微同源相关缺失增加，这与53BP1或DNA-PKcs缺失影响的缺失类型不同。当同时缺失53BP1和XLF时，缺失模式更接近于53BP1单独缺失的表型，即-2和-7 nt缺失增加，而XLF缺失特有的-17至-35 nt缺失增加被抑制，表明53BP1的效应在双突变体中占主导地位。

Combined loss of RIF1 and DNA-PKcs inhibition causes a decrease in No Indel EJ

RIF1 loss causes a similar shift in deletion patterns as DNA-PKcs disruption

RIF1是53BP1的关键下游效应蛋白。研究发现，RIF1的缺失表现出与53BP1缺失非常相似的表型：在DNA-PKcs被抑制时，RIF1缺失会加剧No Indel EJ的缺陷；同时，RIF1缺失也导致微同源缺失的增加，且与DNA-PKcs disruption的效应非叠加。这支持了53BP1-RIF1轴在调控DSB修复结局中的作用。

Influence of 53BP1, RIF1, and DNA-PKcs on HDR and radiosensitivity

最后，研究人员探讨了这些因子对HDR和放射敏感性的影响。DNA-PKcs激酶抑制（M3814）能显著提高HDR效率并导致强烈的放射增敏。53BP1缺失在DNA-PKcs功能正常或缺失的背景下均能提高HDR，但其效应与M3814处理非完全叠加。RIF1的敲降（siRNA）也表现出类似提高HDR的效应。在放射敏感性方面，53BP1或RIF1缺失会导致中等程度的放射敏感性，而DNA-PKcs激酶抑制引起的强烈放射敏感性在53BP1或RIF1缺失的细胞中虽有加剧，但非完全叠加。相比之下，53BP1和DNA-PKcs的双基因敲除则显示出近似叠加的放射敏感性。

讨论与结论

本研究系统地阐明了53BP1-RIF1与DNA-PKcs在调控多样化DSB修复结局中存在的独特遗传相互作用。总结而言，53BP1-RIF1在平末端DSB的精确连接（No Indel EJ）中扮演着备份角色，当DNA-PKcs或XLF功能受损时，其重要性才凸显出来，这可能与其促进DSB末端突触（synapsis）的功能有关。然而，在抑制微同源缺失突变方面，53BP1-RIF1与DNA-PKcs则处于同一通路，共同限制容易出错的修复方式。此外，53BP1-RIF1和DNA-PKcs disruption均能促进HDR并影响细胞的放射敏感性，但它们的效应模式存在差异，尤其是DNA-PKcs激酶抑制表现出比基因敲除更强的影响。

这些发现不仅深化了我们对DNA损伤修复网络复杂性的理解，揭示了关键因子在不同修复层面（效率 vs. 保真度）可能扮演截然不同的角色，而且具有重要的潜在应用价值。DNA-PKcs抑制剂正处于临床开发阶段，用于癌症的放射增敏。本研究提示，同时考虑53BP1-RIF1的状态可能有助于预测肿瘤对这些抑制剂的反应，并为开发新的联合治疗策略提供了理论基础。总之，该研究精妙地描绘了DNA损伤应答核心因子之间相互作用的精细图谱，为基因组稳定性维持机制及相关疾病治疗研究提供了新的视角。