全基因组CRISPR筛选揭示按蚊细胞适应性基因和免疫细胞功能相关基因

《Nature Communications》：A genome-wide CRISPR screen in Anopheles mosquito cells identifies fitness and immune cell function-related genes

本刊推荐：为解析按蚊免疫机制并开发新型控蚊策略，研究人员利用全基因组CRISPR筛选平台，在按蚊细胞中系统性鉴定出1280个细胞适应性相关基因和88个氯屈膦酸盐脂质体抵抗相关基因。通过体内验证发现Tsp3A、PGAP6等基因参与吞噬溶酶体形成过程，首次揭示了氯屈膦酸盐脂质体在昆虫免疫细胞中的分子作用机制，为疟疾传播阻断研究提供了新靶点。

　　

在疟疾防控这场持久战中，按蚊作为疟原虫传播的唯一媒介，其生物学特性一直是研究焦点。尽管当前通过种群控制或阻断传播途径的策略显示出应用潜力，但我们对按蚊免疫系统的认知仍存在巨大空白。特别是在细胞免疫层面，由于缺乏高效的遗传操作工具，研究人员难以系统性地解析按蚊免疫细胞的功能基因网络。这一瓶颈严重制约了新型控蚊技术的研发进程。

近日，哈佛医学院和爱荷华州立大学的联合团队在《Nature Communications》上发表了突破性研究。他们成功构建了按蚊全基因组CRISPR筛选平台，通过两项系统性遗传筛选，揭示了按蚊细胞适应性基因和免疫细胞功能相关基因的全景图谱。这项工作不仅建立了首个按蚊大规模正向遗传学筛选体系，还深入解析了氯屈膦酸盐脂质体介导免疫细胞清除的分子机制，为理解按蚊免疫生物学提供了全新视角。

研究团队采用的核心技术包括：基于重组介导的盒式交换（RMCE）的混合式CRISPR筛选平台、全基因组sgRNA（单向导RNA）文库设计（覆盖93%按蚊基因）、氯屈膦酸盐脂质体阳性选择筛选、体内RNA干扰（RNAi）验证、以及通过荧光脂质体示踪和免疫荧光成像分析吞噬溶酶体形成过程。所有体内实验均使用安哥拉按蚊（Anopheles gambiae）Keele品系。

基因组规模CRISPR敲除筛选鉴定按蚊适应性基因

研究人员首先构建了包含90,208个sgRNA的全基因组文库，通过8周的阴性选择（dropout）筛选，鉴定出1,280个与细胞适应性相关的基因。这些基因显著富集于核糖体、剪接体和蛋白酶体等基础细胞过程，其中393个基因在两个生物学重复中均被高置信度验证。与果蝇和人类细胞筛选数据的比较显示，按蚊适应性基因具有高度保守性，88%的按蚊适应性基因在果蝇S2R+细胞中同样具有适应性功能。

氯屈膦酸盐处理抵抗性的全基因组CRISPR筛选

针对氯屈膦酸盐脂质体作用机制不明确的问题，研究团队设计了阳性选择筛选策略。通过比较连续处理（Clodronate A）和间歇处理（Clodronate B）两种方案，鉴定出88个与脂质体摄取和处理相关的候选基因。其中12个基因在两种处理方案中共同显著富集，包括Pp2A-29B、PPME1等参与蛋白磷酸酶2A（PP2A）复合物调控的关键因子。

体内验证候选基因功能

从筛选结果中选取10个候选基因进行体内RNAi验证，其中5个基因（Tsp3A、PGAP6、Traf6、GstD3、TMEM147）成功敲降并显著影响氯屈膦酸盐脂质体介导的免疫细胞清除。特别是PGAP6和GstD3的沉默能够完全阻断脂质体的细胞清除效应，表明这些基因在脂质体功能中发挥关键作用。

脂质体摄取机制解析

通过细胞吞噬抑制剂细胞松弛素D（CytoD）和网格蛋白介导的内吞抑制剂氯丙嗪的对比实验，证实氯屈膦酸盐脂质体主要通过吞噬作用进入免疫细胞。Traf6基因沉默显著削弱细胞的吞噬能力，表明该基因通过影响吞噬功能参与脂质体摄取过程。

吞噬溶酶体形成的关键基因功能

利用荧光脂质体示踪技术，研究人员发现氯屈膦酸盐脂质体在注射后8小时与溶酶体共定位，形成吞噬溶酶体。Tsp3A、PGAP6和TMEM147基因沉默显著影响脂质体颗粒的降解过程，其表型与溶酶体酸化抑制剂Bafilomycin A1（BAF A1）处理相似，表明这些基因参与吞噬溶酶体形成的关键步骤。

这项研究建立了首个按蚊全基因组CRISPR筛选平台，系统鉴定了细胞适应性基因和免疫相关基因。研究发现氯屈膦酸盐脂质体通过吞噬作用进入细胞，经吞噬溶酶体形成过程实现免疫细胞清除，其中Tsp3A、PGAP6等基因发挥关键作用。这些发现不仅深化了对按蚊免疫细胞功能的理解，也为开发新型疟疾防控策略提供了理论基础和技术平台。该研究展示的筛选方法可广泛应用于其他昆虫系统，推动媒介生物学研究进入功能基因组学时代。