基因编码生物传感器HyPer7在毕赤酵母中实现过氧化氢积累动态的实时监测

《FEMS Yeast Research》：The genetically encoded biosensor HyPer7 enables in-line monitoring of H2O2 accumulation dynamics in the methylotrophic yeast Komagataella phaffii

本研究针对甲基营养型酵母Komagataella phaffii甲醇代谢过程中产生的过氧化氢(H2O2)毒性问题，首次成功应用基因编码荧光生物传感器HyPer7结合微生物反应器实时监测H2O2动态变化。研究发现Aox1是主要产生活性氧的关键酶，并揭示MutS菌株具有更优生产性能的分子机制，为优化酵母细胞工厂和减少氧化应激提供了新策略。

　　

在生物技术领域，甲基营养型酵母Komagataella phaffii（原名Pichia pastoris）因其卓越的蛋白质表达能力而成为重要的微生物细胞工厂。然而，当以甲醇为碳源时，酒精氧化酶（Aox）催化的第一步反应会产生过氧化氢（H₂O₂）这一潜在毒性副产物。活性氧（ROS）在细胞中扮演着双重角色：既是重要的信号分子，又可能造成氧化损伤。长期以来，研究人员只能通过缺乏特异性的荧光染料来间接评估ROS水平，无法实时精确监测H₂O₂的动态变化。

为突破这一技术瓶颈，Victor Mendes Honorato等研究人员在《FEMS Yeast Research》上发表了创新性研究，首次在K. phaffii中成功应用了基因编码的H₂O₂生物传感器HyPer7。这种最新一代的比率型荧光传感器克服了早期版本对pH敏感的缺点，通过将环化排列的绿色荧光蛋白（cpGFP）与来自脑膜炎奈瑟菌的超敏感OxyR结构域融合，实现了对H₂O₂的高特异性检测。

研究团队采用多项关键技术：通过GoldenGate克隆系统构建表达载体，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除AOX基因，结合微生物反应器（BioLector）进行实时荧光监测，并运用荧光显微镜验证传感器功能。这些技术的整合为实时解析K. phaffii中H₂O₂动态提供了完整的技术方案。

表达和外源过氧化氢对HyPer7的响应

研究人员将HyPer7定位于K. phaffii细胞的细胞质中，使用强效的TEF启动子确保组成型高效表达。荧光显微镜分析显示，用0.6 mM H₂O₂处理20分钟后，488 nm激发下的荧光强度显著增加，证实HyPer7在K. phaffii中正确表达且对H₂O₂具有响应性。

在BioLector中培养表达HyPer7的K. phaffii可实现H₂O₂积累和分解动态的在线监测

微生物反应器培养系统能够实时监测荧光信号随时间的变化。通过记录488 nm和400 nm激发的信号并计算氧化/还原（488/400）比率，研究人员发现未处理细胞在培养初期氧化/还原比率没有增加，但在延长培养时间后开始上升，这很可能与细胞生长过程中的呼吸活动相关。

HyPer7对外源H₂O₂和DTT的响应

添加0.01 mM H₂O₂即可引起488/400比率的显著增加，而0.25 mM H₂O₂可使传感器完全氧化。高浓度H₂O₂（≥1 mM）会抑制细胞生长，随着H₂O₂水平下降，细胞恢复生长能力。添加DTT（二硫苏糖醇）会导致比率小幅下降，表明HyPer7能够检测未应激细胞内源代谢产生的低水平H₂O₂。

不同碳源条件下H₂O₂积累的显著变化

在模拟葡萄糖限制或甲醇诱导的培养条件下，甲醇添加后立即引起H₂O₂信号的瞬时增加。使用葡萄糖聚合物（EnPresso系统）模拟补料分批过程时，甲醇诱导细胞对每次甲醇添加都产生快速的H₂O₂信号增加，而葡萄糖限制细胞的比率保持基线水平直至培养结束。

酒精氧化酶基因敲除改变菌株氧化还原特征

研究人员通过CRISPR/Cas9技术构建了三种不同甲醇利用表型菌株：Mut⁺（野生型，含Aox1和Aox2）、Mut^S（△aox1）和Mut^-（△aox1△aox2）。在混合碳源条件下，Mut^S菌株的生长与野生型在限制葡萄糖条件下的生长相当，而Mut^-菌株在以甲醇为唯一碳源时不产生H₂O₂且不生长。

研究明确显示Aox1是主要的甲醇氧化酶和细胞内H₂O₂的主要来源。Mut^S菌株表现出更优的生产性能，因其具有更连续的AOX启动子激活和较低的有毒副产物H₂O₂水平。

这项研究的意义在于首次在K. phaffii中实现了H₂O₂的实时动态监测，为理解甲醇代谢过程中的氧化应激响应提供了直接证据。HyPer7与微生物反应器的结合为研究细胞生理学和生产相关应激提供了强大工具，未来可通过将生物传感器靶向特定细胞器来获得空间分辨率信息。该技术平台不仅有助于优化K. phaffii细胞工厂，也为开发更可持续、氧化应激减少的生产工艺奠定了基础。