Na+/K+-ATPase α亚基的领域特异性突变以不同方式调节果蝇的睡眠和昼夜节律

《Experimental Parasitology》：Domain-specific mutations in Na+/K+-ATPase α subunit differentially regulate sleep and circadian rhythms in Drosophila

钠钾ATP酶α亚基结构域特异性突变通过果蝇模型揭示其对睡眠时长和昼夜节律调控的差异化作用，异源突变影响睡眠易起性，同源突变同时破坏睡眠架构和节律行为，并发现其作用机制涉及非LNv circadian神经元且存在发育阶段依赖性。

　　在生物学研究中，钠钾ATP酶（Na?/K?-ATPase，简称NKA）作为一种关键的膜转运蛋白，其作用机制长期以来受到广泛关注。NKA通过ATP水解驱动钠离子和钾离子的跨膜交换，从而维持细胞膜电位和离子稳态，这一过程对神经元的兴奋性、物质运输以及细胞体积调控至关重要。在人类和果蝇中，NKA的α亚基是其功能核心，主要负责离子转运和结构稳定性。α亚基的结构通常包含十个跨膜螺旋段（TMD），三个明确的细胞内调节区域以及一个相对简单的细胞外结构域。然而，尽管NKAα亚基的突变已被证实与多种神经系统疾病相关，包括睡眠障碍和昼夜节律紊乱，其不同结构域在调控这些生理过程中的具体作用仍不明确。

本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了果蝇模型，模拟了与人类ATP1A1基因相关的临床突变。通过系统分析不同结构域的突变对果蝇睡眠行为和昼夜节律的影响，我们发现，异质性突变（即只在一个等位基因上发生突变）在跨膜或细胞内活化结构域中会导致睡眠时长增加，这可能是由于突变增强了睡眠启动的压力。相反，同源性突变（即两个等位基因均发生突变）则会同时破坏睡眠结构和昼夜节律行为，这种现象在模拟ATPα-CMT2突变的果蝇模型中尤为明显。值得注意的是，异质性突变在细胞内结构域中并未表现出明显的表型变化，这表明不同结构域的突变对睡眠和昼夜节律的调控具有显著差异。

此外，我们还发现NKA对睡眠的调控主要依赖于非LNv（即非背侧神经元）的昼夜节律神经元，且这种调控作用具有发育阶段依赖性。相比之下，NKA在维持内源性昼夜节律方面则需要成年阶段的功能性表达。这一发现揭示了NKAα亚基在不同生理过程中的双重角色：一方面，它通过特定的神经元群体影响睡眠质量；另一方面，它在成年阶段对昼夜节律的维持起着关键作用。这种结构域特异性的功能分化可能解释了为何某些突变仅影响睡眠，而另一些则同时影响睡眠和昼夜节律。

在探索NKA功能时，我们不仅关注α亚基，还考虑了β亚基的潜在作用。β亚基不仅是α/β异源二聚体结构稳定的重要组成部分，还显著调节离子转运活性。研究表明，β亚基的不同亚型在体内表现出不同的调控效果，且它们的表达模式与α亚基并不完全重叠，这提示β亚基可能在α/β复合体之外发挥独立功能。在果蝇中，NKA的β亚基家族包括Nrv1、Nrv2和Nrv3，其中Nrv3在神经系统中高度表达，并在成虫阶段成为主要形式。在果蝇的复眼发育过程中，光感受器逐渐将Nrv2替换为Nrv3，这一过程可能与神经系统的成熟和功能分化有关。

更为重要的是，β亚基的表达与昼夜节律神经元的定位和功能密切相关。例如，研究发现，CG33310（一种未明确功能的NKAβ亚基）与慢poke结合蛋白（SLOB）在昼夜节律神经元的质膜上的定位周期性变化，这一现象可能影响神经元的兴奋性以及睡眠质量。在果蝇中，通过干扰CG33310和SLOB的定位周期，可以观察到神经元的放电模式和膜特性发生改变，从而导致与年龄相关的睡眠质量下降。这些发现进一步强调了β亚基在睡眠调控中的潜在作用，同时也为理解NKA在神经活动中的复杂功能提供了新的视角。

果蝇作为研究睡眠和昼夜节律的重要模式生物，其神经网络虽然相对简单，但高度保守，为解析这些复杂生理过程提供了理想的平台。果蝇的昼夜节律主要由一组核心时钟神经元调控，这些神经元表达PERIOD（PER）和TIMELESS（TIM）等关键蛋白。其中，背侧神经元（DNs）和腹侧侧神经元（LNvs）是调控昼夜节律的主要细胞类型。PDF（色素分散因子）主要在小LNvs和大LNvs中表达，这些细胞作为节律控制的“节拍器”，通过调节其他神经元的活动来协调每日行为节律。PDF信号通过其受体PDFR（一种G蛋白偶联受体）传递，影响环磷酸腺苷（cAMP）信号通路，并在多个神经元群体中同步分子振荡。PDFR表达的输出神经元则将这些分子节律转化为具体的行为表现，如运动活动和睡眠-觉醒周期，从而建立分子钟与行为之间的联系。

果蝇的睡眠行为在调控机制上与哺乳动物具有高度相似性，均受到神经调节物质和稳态机制的调控。例如，DNs通过抑制促进觉醒的神经元来促进睡眠，而PDF神经元则在维持昼夜节律与睡眠之间的同步性方面发挥关键作用。这些相互作用的复杂网络使得果蝇成为研究睡眠和昼夜节律调控机制的理想模型。基于这一生物学基础，我们决定利用果蝇构建与人类ATP1A1突变相关的模型，以深入探讨NKA功能在睡眠调节中的具体作用。

在构建模型过程中，我们首先对人类ATP1A1基因与果蝇ATPα蛋白的序列进行了比对，以确定对应突变位点的同源性。比对结果显示，人类ATP1A1与果蝇ATPα在多个关键区域具有高度保守性，包括跨膜区域（M4、M7、M8）以及A域和N域。我们选择了三个与睡眠障碍相关的突变位点——p.Gln225、p.Gly335和p.Asp933，分别对应果蝇中的p.Gln204、p.Gly314和p.Asp912。通过CRISPR/Cas9技术，我们成功引入了这些突变，并对果蝇的睡眠行为和昼夜节律进行了系统分析。

研究结果表明，异质性突变在跨膜或细胞内活化结构域中会导致睡眠时长显著增加，而同源性突变则会同时影响睡眠结构和昼夜节律行为。这一发现不仅揭示了NKAα亚基在睡眠和昼夜节律调控中的结构域特异性，还为理解突变如何影响这些生理过程提供了新的线索。值得注意的是，某些突变位点（如A域）在异质性突变下并未表现出明显的表型变化，这提示不同结构域可能具有不同的调控路径和生理功能。

进一步的实验表明，NKA对睡眠的调控主要依赖于非LNv神经元，且这种调控作用具有发育阶段依赖性。在果蝇的早期发育阶段，NKA的功能可能更多地影响神经元的成熟和功能分化，而在成年阶段，其作用则更倾向于维持睡眠稳态和昼夜节律。相比之下，NKA在维持内源性昼夜节律方面则需要成年阶段的功能性表达，这可能意味着其在成虫神经系统中的作用更为关键。这种结构域特异性的功能分化可能解释了为何某些突变仅影响睡眠，而另一些则同时影响睡眠和昼夜节律。

在临床研究中，ATP1A1突变已被与多种神经系统疾病相关联，包括癫痫、智力障碍以及睡眠障碍。例如，位于跨膜区域（M3、M4、M7、M8）的ATP1A1突变可能导致离子转运功能受损，进而引发癫痫和智力障碍。而在N域或P-N域之间的螺旋连接区的突变则与Charcot-Marie-Tooth病（CMT2）相关。这些突变不仅影响离子转运，还可能干扰神经元的信号传递和代谢平衡，从而导致多种临床表现。然而，目前尚缺乏对这些突变如何具体影响睡眠行为的系统研究。

本研究填补了这一知识空白，通过构建果蝇模型，我们发现不同结构域的突变会对睡眠和昼夜节律产生不同的影响。异质性突变在跨膜或细胞内活化结构域中主要增强睡眠启动的压力，导致总睡眠时长增加，而同源性突变则会破坏睡眠结构和昼夜节律，提示这些突变可能影响不同的神经调控通路。此外，我们还发现NKA对睡眠的调控作用可能与特定的神经元群体有关，而非LNv神经元可能是主要的调控靶点。这种发现为理解NKA在睡眠调节中的分子机制提供了新的方向。

在探索NKA功能时，我们不仅关注α亚基，还考虑了β亚基的潜在作用。β亚基在NKA异源二聚体中的表达模式和功能特性可能对睡眠和昼夜节律产生重要影响。例如，某些β亚基可能通过调节离子转运活性或影响神经元的兴奋性来间接调控睡眠行为。此外，β亚基的表达可能在不同发育阶段具有不同的调控作用，这可能解释了为何某些突变在幼虫阶段没有明显表型，而在成虫阶段则表现出显著的睡眠和昼夜节律异常。

综上所述，本研究通过构建果蝇模型，系统分析了NKAα亚基不同结构域的突变对睡眠和昼夜节律的影响。研究结果不仅揭示了NKA在调控这些生理过程中的结构域特异性，还为理解突变如何导致睡眠障碍提供了新的视角。未来的研究可以进一步探讨NKAβ亚基在睡眠调节中的具体作用，以及不同结构域突变如何通过特定的神经调控通路影响睡眠行为和昼夜节律。这些发现有望为开发针对睡眠障碍和相关神经疾病的治疗策略提供新的思路和依据。