在Na+/K+-ATP酶的心脏糖苷结合位点进行替换，并不能解释Steinernema昆虫病原线虫之间对盐度耐受性的差异

《Journal of Invertebrate Pathology》：Substitutions in the cardiac glycoside binding site of the Na+/K+-ATPase do not explain differences in salinity tolerance between Steinernema entomopathogenic nematodes

盐胁迫下 Steinernema carpocapsae 的钠泵蛋白氨基酸 substitutions 及其生态适应性机制研究。通过 CRISPR/Cas9 基因编辑技术构建 Caenorhabditis elegans 模型，发现 substitutions K120M 和 N122H 单独存在时提升盐耐受性，但双突变体未表现出协同效应，提示其进化可能受植物心脏糖苷诱导。研究揭示了钠泵蛋白 extracellular loop 变异对土壤食物网功能及农业生物防治应用的影响。

　　土壤盐度在全球范围内存在显著差异，这种差异既受到自然因素的影响，也与人类活动密切相关。例如，农业、道路盐的使用、海平面上升以及沙漠化等现象都会导致土壤盐度的变化。土壤盐度的升高可能对生物产生广泛的影响，特别是对土壤中的食物网结构。作为寄生虫的昆虫病原线虫（Entomopathogenic Nematodes, EPNs）在土壤食物网中占据关键位置，它们通过捕食害虫在农业中发挥重要的生物防治作用。

研究发现，EPN中的一种——*Steinernema carpocapsae*（S. carpocapsae）表现出比其同源种更高的盐度耐受能力。我们最近确认，S. carpocapsae在钠泵（Na?/K?-ATPase）的第一个胞外环中，进化出了两个独特的氨基酸替换（K120M和N122H）。这些替换是否能够解释S. carpocapsae在盐度环境中的较低敏感性，是我们研究的重点之一。实验结果表明，S. carpocapsae在高盐度环境中表现出更强的盐度耐受能力，并且能够更有效地寻找并感染昆虫宿主，相比其同源种*S. feltiae*和*S. hermaphroditum*。

为了进一步探索这些氨基酸替换在S. carpocapsae进化中的作用，我们使用CRISPR基因编辑技术，将这些替换引入到模式生物*Caenorhabditis elegans*（C. elegans）中。实验发现，C. elegans中单个替换的突变体表现出增强的盐度耐受能力，然而当两个替换同时存在时，这种能力却消失了，且钠泵的功能与S. carpocapsae相似。这一现象表明，这两个替换之间可能存在负性表型交互（negative epistasis），即它们并不直接导致不同*Steinernema*种间盐度耐受能力的差异。

钠泵的进化可能受到植物释放的某些次级代谢产物——心脏苷（cardiac glycosides, CGs）的影响。这些化合物主要由一些植物产生，如乳草（milkweeds），并被某些以这些植物为食的昆虫宿主所储存。心脏苷已知能够靶向钠泵的第一个胞外环，从而影响其功能。因此，S. carpocapsae中钠泵的进化可能并非为了直接适应高盐度环境，而是与这些化合物的接触有关。

此外，研究表明，昆虫病原线虫在高盐度环境中可能更倾向于寻找其宿主，因为它们的宿主昆虫往往在土壤中活动以满足生理上的盐需求。例如，蝴蝶通过“ puddling”行为从土壤中获取盐分，而它们的植物性饮食通常缺乏足够的钠。这种行为使得昆虫病原线虫更容易接触到盐度环境，从而可能影响它们的生存和繁殖能力。

研究还发现，S. carpocapsae与其他*Steinernema*种在高盐度环境中的表现存在差异。例如，S. riobrave作为一种广泛适应的昆虫病原线虫，其“cruiser”觅食策略在高盐度环境中受到了负面影响。这表明，不同种的昆虫病原线虫在面对盐度压力时可能表现出不同的适应策略。这些差异不仅影响它们的生存能力，还可能影响其在农业中的应用效果。

为了验证这些假设，我们使用了*Caenorhabditis elegans*作为模型系统，研究了S. carpocapsae中钠泵的两个替换（K120M和N122H）是否能够解释其较高的盐度耐受能力。我们发现，C. elegans中单个替换的突变体表现出增强的盐度耐受能力，但当两个替换同时存在时，这种能力却减弱了。这一现象表明，这两个替换之间可能存在复杂的遗传交互作用，而并非简单的功能增强。

我们的研究还涉及了昆虫病原线虫在不同盐度环境中的行为和生理差异。例如，在高盐度环境中，S. carpocapsae的幼虫和成虫表现出更强的觅食能力和更高的相对适应性。这种能力可能与其钠泵的进化有关，也可能受到其他因素的影响，如环境中的化学信号或温度变化。此外，我们还发现，某些极端环境条件，如渗透压变化，可能放大某些基因突变的表型影响，从而进一步影响昆虫病原线虫的适应能力。

研究的目的是为了理解昆虫病原线虫如何适应环境中的盐度变化，并探索其在农业中的应用潜力。由于这些线虫在生物防治中具有重要作用，因此研究它们的适应机制对于提高农业生产的可持续性和效率具有重要意义。此外，昆虫病原线虫的进化和适应能力也可能对多营养级相互作用的生态和进化动态产生影响，为生态学和进化生物学的研究提供新的视角。

在实验设计中，我们选择了*S. carpocapsae*、*S. feltiae*和*S. hermaphroditum*三种昆虫病原线虫作为研究对象，并分别与它们的共生细菌*Enterobacter* spp.和*Xenorhabdus* spp.进行配对。这些线虫在不同的盐度环境中表现出不同的行为模式，这为我们研究它们的适应机制提供了基础。通过使用化学趋化性实验（chemotaxis behavioral assay），我们测试了这些线虫对不同浓度的NaCl的偏好，并发现它们在高盐度环境中表现出更强的适应能力。

研究还涉及了昆虫病原线虫的觅食行为和环境信号的响应。例如，C. elegans突变体在不同盐度环境中的行为表现可能受到钠泵功能的影响。这表明，钠泵的进化可能与昆虫病原线虫的觅食行为和环境适应能力密切相关。此外，研究还发现，某些昆虫病原线虫在高盐度环境中可能表现出更强的感染能力，这可能与其钠泵的进化有关，也可能受到其他因素的影响。

综上所述，昆虫病原线虫在高盐度环境中的适应能力可能与其钠泵的进化有关，而钠泵的进化可能受到心脏苷等次级代谢产物的影响。这些发现不仅有助于理解昆虫病原线虫如何适应环境变化，还可能对它们在农业中的应用提供新的思路。未来的研究可以进一步探索这些线虫在不同盐度环境中的适应机制，以及它们与其他生物之间的相互作用。这些研究将有助于提高农业生产的可持续性和效率，并为生态学和进化生物学的研究提供新的视角。