CRISPR-Cas9的“快递革命”：细胞外囊泡搭载光控释放系统实现精准基因编辑投递

《Nature Communications》：A modular strategy for extracellular vesicle-mediated CRISPR-Cas9 delivery through aptamer-based loading and UV-activated cargo release

创新光控-EV平台突破Cas9递送瓶颈，编辑效率由2%跃升至28%，为安全可编程体内基因治疗奠定新范式。

　　

CRISPR-Cas9被誉为“基因魔剪”，却长期被“最后一公里”卡脖子：Cas9_{复合物体积大、带负电、免疫原性高，病毒载体容量受限，脂质体易陷溶酶体“泥潭”，细胞穿透肽又会在血清里“散架”。安全、高效、可扩展的递送方案成为基因编辑从实验室走向临床的“圣杯”。细胞外囊泡（EVs）自带跨屏障、低免疫优势，却苦于“装货难、卸货更难”。面对这一僵局，Omnia M. Elsharkasy与Charlotte V. Hegeman领衔的团队决定给EV做一次“模块化升级”，让Cas9“搭便车”还能“到站即下车”。研究成果于2025年11月在线发表于《Nature Communications》。}

为回答“如何在不破坏Cas9功能的前提下高效装载并可控释放”，作者设计了一套“适配体-光控”双保险策略：把MS2衣壳蛋白（MCP）融合到EV富集蛋白CD63的腔内端，中间插入可在395 nm紫外光下断裂的PhoCl结构域；同时在sgRNA的tetraloop与第二茎环插入MS2适配体。细胞共表达后，Cas9_{通过“RNA手柄”被锚定到EV膜内侧；EV纯化后只需“照一下”，光裂解使RNP与膜分离，实现“货物离舱”。为了促进内体逃逸，研究者还共表达VSV-G融合蛋白，让EV具备“溶酶体破膜”能力。}

关键技术方法

1. 基于MS2适配体-MCP高亲和力的RNA编程装载（TAMEL策略升级）
2. 光敏断裂蛋白PhoCl介导的UV触发释放
3. Tangential flow filtration（TFF）+SEC的EV纯化与NTA粒径表征
4. 荧光“红绿灯”报告系统（NHEJ产生移码→eGFP点亮）
5. T7E1酶切与BsaHI-RFLP定量体内外源编辑效率
6. 光共聚焦实时追踪Cas9-mStayGold核内转运

研究结果

模块化装载策略的构建与验证
将MCP-CD63与Cas9、MS2-sgRNA共转HEK293T，48 h后EV内Cas9蛋白富集350倍，sgRNA丰度提升约350倍，密度梯度离心与CD63免疫捕获证实RNP与EV共定位。

光控释放大幅提升Cas9功能递送
单纯增加装载仅使报告基因激活由0.2%升至2%。插入PhoCl并经20 min UV照射后，同样剂量EV把eGFP^{细胞比例提高到28%，且未见UV对EV粒径、蛋白标志物或sgRNA完整性造成损伤；全基因组NGS未发现脱靶增加，MTS无毒性信号。}

不同EV富集蛋白影响递送效率
比较CD9、CD63、CD81、ARRDC1及豆蔻酰化标签，发现CD9-PhoCl组在相同粒子剂量下编辑效率达57%，显著优于CD63，Western blot证实其Cas9装载量同步提升。

VSV-G是核定位的“钥匙”
去除VSV-G后，即使装载量充足，报告细胞eGFP^{率仍接近0；共聚焦显示VSV-G EV处理后2 h核内Cas9-mStayGold信号显著升高，提示其介导内体逃逸。}

多功能Cas9变体的通用递送

• dCas9-VPR转录激活：TRE-eGFP报告系统在4×10 ^{EV/孔剂量下ΔMFI提升4倍，实现可逆转录上调。}
• ABE8e腺嘌呤碱基编辑：采用仅tetraloop带MS2的sgRNA 1.1，避免第二茎环位阻，EV剂量1×10^{时eGFP激活升至30%，T7E1与BsaHI证实内源CCR5位点A→G转换效率与质粒转染相当。}

结论与讨论
该研究首次将“适配体装载+光控释放”整合进同一EV平台，突破性地把Cas9_{的功能递送效率提升一个数量级，同时保持低脱靶、低毒性。模块化设计允许Cas9、转录激活子或碱基编辑器“即插即用”，只需更换sgRNA与功能蛋白即可。尽管UV组织穿透力有限，体外光释放或替代长波长光开关蛋白为未来体内应用提供升级路径；VSV-G免疫原性亦可通过人源融合蛋白替换。论文为基因编辑治疗提供了一种安全、可扩展且生产便捷的“无病毒、无脂质”递送新范式，并提示EV工程化可广泛适用于mRNA、CRISPRi或prime editing等更多场景。}