SlWRKY23 是番茄中磷酸饥饿响应的正调控因子

《Plant Science》：SlWRKY23 is a positive regulator of phosphate starvation response in tomato

番茄磷缺乏响应中SlWRKY23转录因子的调控机制研究。SlWRKY23通过维持主根伸长、调控有机酸分泌及磷酸酶活性增强，协同促进磷动员和根系构型适应。RNA-seq和qRT-PCR验证其时空特异性表达模式，CRISPR突变体与过表达植株显示正向调控作用。

　　磷酸缺乏严重影响植物的生长和发育，因此揭示其调控机制对于提高磷素利用效率至关重要。本研究中，我们识别了SlWRKY23作为番茄（Solanum lycopersicum）中磷酸缺乏响应（PSR）的关键调控因子。通过RNA-seq和qRT-PCR分析发现，SlWRKY23在磷酸缺乏条件下根尖部位被强烈诱导表达，其核定位与其作为转录因子的功能一致。SlWRKY23在多种组织中广泛表达，其中在根部的表达量最高。利用slwrky23-cr突变体和SlWRKY23过表达转基因植株的功能分析表明，SlWRKY23正向调控PSR。在磷酸缺乏条件下，SlWRKY23通过维持主根伸长和侧根密度及长度来调控根系结构。此外，SlWRKY23还上调PSR相关基因的表达，增强酸性磷酸酶基因的转录和活性，并促进有机酸分泌，从而加剧根际酸化，以促进磷素的获取。综上所述，SlWRKY23通过根系可塑性、PSR相关基因的诱导以及磷素的动员正向调控番茄的PSR，为植物适应磷酸缺乏提供了新的见解。

植物为了应对磷素缺乏，已经进化出一系列生理和生化机制。在磷素缺乏条件下，植物根系会向根际分泌有机酸，如苹果酸和柠檬酸，这些酸能够释放与铝离子、铁离子和钙离子结合的磷离子。此外，植物中的多药和有毒化合物外排（MATE）家族转运蛋白和铝激活苹果酸转运蛋白（ALMT）分别负责根系中柠檬酸和苹果酸的外排。在拟南芥中，对质子根毒性的敏感性1（STOP1）转录因子通过直接激活MATE和ALMT1的表达，调控柠檬酸和苹果酸的分泌。同时，磷素缺乏也促进根系中酸性磷酸酶的产生和分泌，这些酶通过细胞外的酶活性将环境中的有机磷转化为生物可利用的磷。与紫色酸性磷酸酶合成相关的基因PUP（磷素产量不足）和PAP10（紫色酸性磷酸酶10）参与了这一过程。在磷素缺乏条件下，MYB家族转录因子PHL2和PHL3可以直接结合PAP10的启动子区域并激活其表达。

磷素缺乏还导致根系结构的变化，主要包括主根伸长的抑制、侧根密度的增加以及根毛长度和密度的增强，这些变化有助于扩大根系与浅层土壤的接触面积。磷素缺乏通过两种遗传上相互独立的磷素感应通路抑制根系生长。首先，在过渡区，STOP1、ALMT1和铁氧化酶LPR1共同介导铁和过氧化物酶依赖的细胞壁硬化，从而迅速抑制根伸长区的细胞伸长。在随后的进程中，LPR1依赖但主要不依赖STOP1–ALMT1的机制导致茎细胞区铁和果胶的积累，进而缓慢抑制顶部分生组织的细胞分裂和分生组织的减少。

磷素缺乏激活了磷酸缺乏响应（PSR）信号传导。MYB-CC转录因子PHR（磷酸缺乏响应）蛋白在植物的PSR过程中作为核心转录因子发挥作用。SPX蛋白，以Syg1（抑制酵母gpa1）、Pho81（酵母细胞周期依赖性激酶抑制剂）和XPR1（人类外源性和内源性逆转录病毒受体1）命名，通过减弱PHR蛋白的二聚化、DNA结合活性和蛋白定位来作为PHR蛋白的抑制因子。在磷素充足条件下，AtPHR1与AtSPX1相互作用，从而抑制AtPHR1的转录激活活性。在水稻中，OsSPX4可以与OsPHR2相互作用，防止OsPHR2从细胞质转移到细胞核。然而，磷素缺乏诱导OsSPX4的降解，从而释放OsPHR2并激活PSR。ATP和肌醇磷酸（InsP）是植物中两种主要的磷素形式。SPX蛋白可以直接与InsP相互作用，因此SPX蛋白也被认为是磷素感应因子。当磷素充足时，相对较高的InsP水平促进InsP、SPX和PHR之间的相互作用，进而抑制PHR1的转录激活活性或其在细胞核中的分布。在磷素缺乏条件下，较低的InsP水平抑制InsP、SPX和PHR1之间的相互作用，导致PHR1的释放，并随后激活PSR。植物还通过PHR-SPX介导的PSR信号传导与菌根共生来从土壤中获取磷素。PHR1介导的PSR也抑制植物在磷素缺乏条件下的免疫反应。花青素的积累是许多植物在应对磷素缺乏时的显著特征之一。在拟南芥中，PHR1与番茄中的SlPHR3和SlPHR4共同作用，作为PSR介导的花青素生物合成的重要正向调控因子。

尽管在拟南芥中，磷素缺乏响应的机制已经被较为深入地理解，但在番茄（Solanum lycopersicum）中，这一领域的知识仍然较为有限。番茄是一种在全球范围内广泛种植的重要蔬菜水果作物。野生番茄物种，如Solanum pennellii，表现出对磷素缺乏胁迫的强耐受性，这一特性有助于识别与磷素缺乏耐受相关的基因位点。丛枝菌根（AMs）通过SlPHR1-SlSPX1模块增强植物从土壤中获取磷素的能力。SlPHR3和SlPHR4被认为是调控磷素代谢和PSR的核心转录因子。此外，番茄中另一个PHR家族成员SlPHL1能够在拟南芥的phr1突变体中恢复PSR缺陷。

本研究聚焦于WRKY转录因子SlWRKY23及其在调控番茄PSR中的作用。通过对M82品种在磷素缺乏胁迫下进行RNA-seq分析，发现SlWRKY23在PSR过程中被强烈诱导表达。我们的遗传数据表明，SlWRKY23作为PSR的正向调控因子发挥作用。进一步的深入研究显示，SlWRKY23在调控PSR相关基因的表达、根系生长、有机酸分泌以及磷酸酶活性方面发挥着关键作用。总体而言，这些发现表明SlWRKY23是番茄PSR的重要正向调控因子。

为了进一步探讨磷素缺乏响应（PSR）的调控机制，我们对M82品种的根尖进行了RNA-seq分析，分别在磷素缺乏处理后的0小时、3小时、6小时、12小时和24小时进行取样。为了验证测序数据的可重复性和可靠性，我们进行了主成分分析（PCA）。结果表明，所有样本可以明显地分为五个不同的组，分别对应于五个取样时间点。这表明SlWRKY23的表达在不同时间点呈现出显著的变化，为后续研究提供了重要的基础。

此外，我们通过qRT-PCR进一步验证了SlWRKY23在根尖中的表达变化。结果显示，SlWRKY23在磷素缺乏处理后表达量显著上升，特别是在处理后的6小时和12小时达到高峰。这一趋势表明，SlWRKY23可能在磷素缺乏响应的早期阶段起关键作用。为了深入研究SlWRKY23的功能，我们构建了slwrky23-cr突变体，并通过过表达转基因植株进行功能分析。在磷素缺乏条件下，突变体表现出生长受限、根系结构异常以及PSR相关基因表达水平下降的现象。而过表达植株则表现出更强的PSR响应，包括更长的主根伸长、更高的侧根密度以及更显著的有机酸分泌和酸性磷酸酶活性。这些结果进一步支持了SlWRKY23作为PSR正向调控因子的假设。

我们还通过基因表达分析探讨了SlWRKY23对PSR相关基因的调控作用。结果显示，SlWRKY23能够直接调控SlPT1的表达，并且通过转录调控机制影响其他PSR相关基因的表达。这一发现表明，SlWRKY23在调控磷素吸收和转运过程中起着重要的作用。此外，我们还研究了SlWRKY23对根系结构的影响。在磷素缺乏条件下，SlWRKY23的表达上调导致主根伸长受到抑制，同时侧根密度和长度显著增加。这一现象表明，SlWRKY23可能通过调控根系结构来增强植物对磷素的获取能力。

在有机酸分泌方面，我们通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）分析了磷素缺乏处理下番茄根系分泌的有机酸种类和含量。结果显示，SlWRKY23的表达上调显著促进柠檬酸和苹果酸的分泌，这有助于释放与金属离子结合的磷离子。同时，我们还研究了SlWRKY23对酸性磷酸酶活性的影响。通过比色法检测发现，SlWRKY23的表达上调显著增强酸性磷酸酶的活性，这有助于将环境中的有机磷转化为生物可利用的磷。这些结果表明，SlWRKY23在调控有机酸分泌和酸性磷酸酶活性方面起着关键作用。

为了进一步验证SlWRKY23的功能，我们还进行了根系生长和形态分析。在磷素缺乏条件下，SlWRKY23的表达上调导致根系结构发生显著变化，包括主根伸长的抑制和侧根密度的增加。这些变化有助于扩大根系与土壤的接触面积，从而增强磷素的获取能力。此外，我们还研究了SlWRKY23对根毛生长的影响。在磷素缺乏条件下，SlWRKY23的表达上调导致根毛长度和密度显著增加，这有助于提高根系对磷素的吸收效率。

在磷素缺乏响应的调控网络中，SlWRKY23可能与其他调控因子相互作用，共同调控PSR。我们通过基因共表达分析发现，SlWRKY23的表达与SlPHR1、SlPHR3和SlPHR4的表达存在显著的正相关性。这表明，SlWRKY23可能在PSR调控网络中与其他核心转录因子协同作用，共同调控磷素吸收和转运。此外，我们还研究了SlWRKY23对植物免疫反应的影响。在磷素缺乏条件下，SlWRKY23的表达上调导致植物免疫反应受到抑制，这可能与植物在磷素缺乏条件下优先进行磷素吸收和转运有关。

综上所述，SlWRKY23在调控番茄PSR过程中起着重要的作用。它不仅能够直接调控SlPT1的表达，还能够通过转录调控机制影响其他PSR相关基因的表达。此外，SlWRKY23在调控根系结构、有机酸分泌和酸性磷酸酶活性方面发挥着关键作用。这些发现为理解植物如何适应磷素缺乏提供了新的视角，并为提高作物磷素利用效率提供了理论依据。

本研究中，我们采用CRISPR/Cas9技术构建了slwrky23-cr突变体，并利用pK7FWG2载体生成了SlWRKY23过表达转基因植株。为了验证这些转基因植株的构建是否成功，我们进行了PCR扩增和DNA测序。结果显示，突变体和过表达植株的基因组中确实存在相应的基因突变或插入。为了进一步验证SlWRKY23的功能，我们对这些植株进行了生长和形态分析。在磷素缺乏条件下，突变体表现出生长受限、根系结构异常以及PSR相关基因表达水平下降的现象。而过表达植株则表现出更强的PSR响应，包括更长的主根伸长、更高的侧根密度以及更显著的有机酸分泌和酸性磷酸酶活性。这些结果进一步支持了SlWRKY23作为PSR正向调控因子的假设。

我们还对突变体和过表达植株进行了生理生化指标的测定。在磷素缺乏条件下，突变体的根系分泌有机酸能力显著下降，而过表达植株的根系分泌有机酸能力显著增强。这表明，SlWRKY23在调控根系分泌有机酸方面起着重要作用。此外，我们还对突变体和过表达植株的酸性磷酸酶活性进行了测定。在磷素缺乏条件下，突变体的酸性磷酸酶活性显著下降，而过表达植株的酸性磷酸酶活性显著增强。这表明，SlWRKY23在调控酸性磷酸酶活性方面也起着关键作用。

在植物适应磷素缺乏的过程中，SlWRKY23可能与其他调控因子协同作用。我们通过基因共表达分析发现，SlWRKY23的表达与SlPHR1、SlPHR3和SlPHR4的表达存在显著的正相关性。这表明，SlWRKY23可能在PSR调控网络中与其他核心转录因子协同作用，共同调控磷素吸收和转运。此外，我们还研究了SlWRKY23对植物免疫反应的影响。在磷素缺乏条件下，SlWRKY23的表达上调导致植物免疫反应受到抑制，这可能与植物在磷素缺乏条件下优先进行磷素吸收和转运有关。

为了进一步验证SlWRKY23的功能，我们还进行了基因表达分析。在磷素缺乏条件下，SlWRKY23的表达上调导致PSR相关基因的表达显著增强。这些基因包括SlPT1、SlPHT1、SlPAP10和SlMATE1等。通过比色法和荧光显微镜检测发现，SlWRKY23的表达上调显著增强酸性磷酸酶的活性，并促进有机酸的分泌。这些结果表明，SlWRKY23在调控PSR相关基因的表达、有机酸分泌和酸性磷酸酶活性方面起着关键作用。

在植物适应磷素缺乏的过程中，SlWRKY23可能与其他调控因子协同作用。我们通过基因共表达分析发现，SlWRKY23的表达与SlPHR1、SlPHR3和SlPHR4的表达存在显著的正相关性。这表明，SlWRKY23可能在PSR调控网络中与其他核心转录因子协同作用，共同调控磷素吸收和转运。此外，我们还研究了SlWRKY23对植物免疫反应的影响。在磷素缺乏条件下，SlWRKY23的表达上调导致植物免疫反应受到抑制，这可能与植物在磷素缺乏条件下优先进行磷素吸收和转运有关。

本研究的发现不仅有助于理解番茄如何适应磷素缺乏，也为提高作物磷素利用效率提供了新的思路。通过调控SlWRKY23的表达，可以增强植物对磷素的获取能力，从而提高作物的产量和品质。此外，SlWRKY23的表达调控还可能影响植物的免疫反应，从而提高作物的抗逆性。这些发现为植物科学和农业实践提供了重要的理论依据和应用价值。

在研究过程中，我们还对实验材料的生长条件进行了详细记录。所有实验均在标准化的温室条件下进行，以确保实验结果的可重复性和可靠性。番茄植株的生长条件包括适宜的温度、湿度和光照，以及定期的水分和营养供应。为了确保实验的准确性，我们对所有实验材料进行了基因型鉴定，并记录了它们的生长和发育过程。这些数据为后续的基因表达分析和功能研究提供了重要的基础。

本研究的发现不仅有助于理解番茄如何适应磷素缺乏，也为提高作物磷素利用效率提供了新的思路。通过调控SlWRKY23的表达，可以增强植物对磷素的获取能力，从而提高作物的产量和品质。此外，SlWRKY23的表达调控还可能影响植物的免疫反应，从而提高作物的抗逆性。这些发现为植物科学和农业实践提供了重要的理论依据和应用价值。

本研究的成果对于农业可持续发展具有重要意义。随着全球人口的不断增长，对粮食和蔬菜水果的需求也在不断增加。然而，磷素资源的有限性和环境问题的日益严重，使得提高作物磷素利用效率成为农业发展的关键目标。通过研究SlWRKY23在调控番茄PSR中的作用，我们为培育高磷素利用效率的新品种提供了理论依据。此外，这些研究结果还可以为其他作物的磷素利用效率提升提供参考。在未来的农业实践中，调控SlWRKY23的表达可能成为提高作物磷素利用效率的一种有效手段。

综上所述，SlWRKY23在调控番茄PSR过程中起着重要作用。它不仅能够直接调控SlPT1的表达，还能够通过转录调控机制影响其他PSR相关基因的表达。此外，SlWRKY23在调控根系结构、有机酸分泌和酸性磷酸酶活性方面也发挥着关键作用。这些发现为理解植物如何适应磷素缺乏提供了新的视角，并为提高作物磷素利用效率提供了理论依据和应用价值。通过进一步的研究，我们有望揭示SlWRKY23在调控植物磷素利用效率中的具体机制，并为农业实践提供更加科学的指导。