利用RPA-CRISPR/Cas12a技术建立口蹄疫病毒O血清型的核酸检测方法

《Journal of Virological Methods》：Establishment of a nucleic acid detection method for foot-and-mouth disease virus serotype O utilizing RPA-CRISPR/Cas12a technology

重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a技术联用，建立了一种快速、直观的口蹄疫病毒O型（FMDV-O）核酸检测方法。通过优化特异性引物和crRNA序列，系统验证了检测限为2.6×102 copies/μL，特异性高于传统PCR，且在临床样本中检测效率显著提升。该平台兼具高灵敏度、特异性及现场适用性，为FMD防控提供新工具。

　　本文介绍了一种基于重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a技术结合的新方法，用于快速、可视化地检测口蹄疫病毒O型（FMDV-O）的核酸。口蹄疫是一种严重影响畜牧业的急性、高度传染性的病毒性疾病，主要影响偶蹄动物，如牛、猪和羊。该病被世界动物卫生组织（WOAH）列为必须报告的陆地动物疾病，其病毒被划分为七个免疫学上不同的血清型，其中O型是全球最为常见的血清型，并与历史上最多的口蹄疫爆发相关。由于感染一种血清型并不能提供对其他血清型的交叉保护，因此任何血清型都可能独立引发疫情。在临床中，该病表现出特征性的症状，如发热、跛行和口鼻、蹄部及乳腺等部位的水疱。尽管成年动物的死亡率通常较低，但幼畜感染后可能引发心肌炎和心脏退行性变化，导致较高的死亡率。

传统的口蹄疫检测方法包括补体结合试验、病毒中和试验（VNT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等。然而，这些方法往往需要复杂的设备、较长的检测时间和专业的操作人员，难以满足快速诊断、现场检测和大规模筛查的需求。因此，开发一种简便、快速、高灵敏度和高特异性的检测方法显得尤为重要。

RPA作为一种等温核酸扩增技术，模仿了体内的DNA复制机制，通过重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换聚合酶的协同作用，实现对目标序列的扩增。其操作温度较低（37–42°C），不需要高温变性步骤，从而实现了快速、高效和特异的扩增过程。RPA技术在检测速度、操作简便性和能源效率方面具有显著优势，特别适用于现场检测和快速诊断。

CRISPR/Cas系统是原核生物中的一种适应性免疫机制，其特征在于密集的短回文重复序列（CRISPR）。Cas12a（也称为Cpf1）是一种II类V型效应蛋白，具有双链DNA（dsDNA）内切酶活性。当Cas12a与CRISPR衍生的RNA（crRNA）结合，并识别出目标dsDNA序列时，其会激活并表现出对非目标单链DNA（ssDNA）的非特异性切割活性。这一特性使得Cas12a在构建高特异性的核酸检测平台方面具有巨大潜力，广泛应用于细菌、病毒和寄生虫等多种病原体的检测。

在本研究中，科学家们将RPA与CRISPR/Cas12a技术相结合，构建了一种用于检测FMDV-O核酸的新型诊断平台。该方法首先通过RPA对目标dsDNA区域进行扩增，随后Cas12a/crRNA复合物特异性地结合扩增产物，触发其非特异性切割活性。这一过程导致荧光探针的切割，从而产生可测量的荧光信号。通过检测荧光信号的强度，可以判断目标核酸的存在与否。该方法不仅实现了快速检测，还具备良好的可视化特性，有助于提高检测的准确性和可操作性。

研究团队设计并优化了针对FMDV-O保守3D基因区域的RPA引物和CRISPR RNA（crRNA）序列。通过对不同组合的评估，确定了最优的RPA引物和crRNA组合，即RPA-F1/R1与crRNA1的配对。该组合在37°C下经过20分钟的孵育后，能够达到2.60×102 copies/μL的检测限。同时，特异性分析表明，该方法仅对FMDV-O质粒产生阳性反应，未观察到与其他病原体的交叉反应。

在临床样本的应用中，该方法表现出比传统PCR更高的检测率。这表明，该检测方法在实际应用中具有良好的性能，能够有效地应用于口蹄疫的诊断、流行病学监测和现场检测。此外，该方法的快速性、操作简便性和高灵敏度使其在临床和现场检测中具有显著优势，为提高口蹄疫防控效率提供了新的技术支持。

本研究还涉及了质粒和病毒样本的准备。用于FMDV-O核酸标准的质粒pUC57-FMDV-3D由商业公司合成。其他病毒样本，如牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛瘟病毒（LSDV）和轮状病毒（MRV）的核酸，则从实验室保存的样本中提取。对于RNA病毒，其核酸首先被逆转录为互补DNA（cDNA），以便进行后续检测。

在RPA扩增效率的评估中，通过琼脂糖凝胶电泳分析，确认了所设计的四种RPA引物对均能够有效扩增目标序列，且扩增产物具有较强的信号强度和良好的特异性。这些结果表明，所有引物对在后续的CRISPR/Cas12a检测中均表现出良好的性能，并被保留用于进一步研究。

在选择最优的RPA引物和crRNA组合时，研究团队评估了八种可能的组合，以确定在检测灵敏度和特异性方面表现最佳的方案。通过对不同条件的测试，最终确定了RPA-F1/R1与crRNA1的组合为最优选择。该组合在37°C下经过20分钟的孵育后，能够实现对目标质粒DNA的高效扩增，并通过Cas12a的非特异性切割活性产生可测量的荧光信号。

此外，研究团队还对检测方法的适用性进行了初步评估，包括其在不同环境下的稳定性和对多种样本类型的适应能力。这些评估结果表明，该方法不仅适用于实验室环境，还能够在现场条件下实现有效的检测，为大规模筛查和快速诊断提供了可行的方案。

该研究的成果为口蹄疫的防控提供了新的技术支持，有助于提高诊断的准确性和效率。同时，该方法的可视化特性使其更容易被非专业人员理解和操作，从而扩大了其在实际应用中的范围。此外，该方法的快速性使其能够在疫情爆发初期迅速检测病原体，为采取防控措施争取宝贵时间。

本研究还涉及了对不同检测条件的优化，包括反应温度、时间、引物浓度和crRNA浓度等。通过系统的实验设计和优化，研究团队确定了最佳的反应体系，即50 nM的Cas12a蛋白和200 nM的crRNA。这一体系不仅能够实现高效的扩增和特异性识别，还能够在较短时间内完成检测，满足现场检测的需求。

在讨论部分，研究团队分析了该方法在实际应用中的优势和潜在挑战。虽然该方法在实验室条件下表现出良好的性能，但在实际应用中仍需考虑环境因素、样本处理方式和检测设备的可用性等问题。此外，该方法的稳定性在不同温度和湿度条件下仍需进一步验证，以确保其在各种环境下的适用性。

该研究还强调了该方法在口蹄疫防控中的重要性。口蹄疫在全球范围内仍然流行，特别是在亚洲、中东和非洲等地区。在中国，多个省份如重庆、广东、广西和新疆等地均报告过口蹄疫的爆发，给畜牧业带来了巨大的经济损失。因此，开发一种快速、准确、简便的检测方法对于控制疫情、减少经济损失具有重要意义。

综上所述，本研究成功开发了一种基于RPA-Cas12a技术的新型诊断平台，用于检测FMDV-O的核酸。该方法在灵敏度、特异性和操作简便性方面表现出色，为口蹄疫的快速诊断、流行病学监测和现场检测提供了新的技术支持。同时，该方法的可视化特性使其更容易被广泛应用，为提高口蹄疫防控效率和减少经济损失提供了重要的科学依据。